Лабораторная работа №2 методы исследования в биохимии Фотометрия

Цель работы:

Ознакомиться с одним из наиболее распространенных в биохимии методов:

1. количественного определения веществ в исследуемом растворе.

2. определения активности ферментов.

1. Принцип и техника колориметрирования. Устройство и правила работы на кфк-2

Задача: ознакомиться с основными принципами и правилами работы на КФК-2.

Фотометрия – метод количественного анализа, основанный на определении концентрации вещества по спектру поглощения, испускания или флуоресценции.

В зависимости от характера возникающих изменений выделяется несколько видов фотометрии (колориметрия, нефелометрия, турбидиметрия, флуориметрия, рефрактометрия, поляриметрия и др.). Фотометрические методы анализа характеризуются высокой чувствительностью, достигающей 10^-4-10^-6% определяемого элемента в твердых образцах и 10^-5-10^-7% – в водных растворах. Колориметрический метод получил самое широкое распространение среди биохимических методов количественного определения веществ в биологических объектах.

Фотометрические приборы делятся на две большие группы: фото­электроколориметры и спектрофотометры.

В фотоэлектроколориметрах нужные спектральные диапазоны вы­деляют при помощи светофильтров (красного, зеленого, синего, фиолето­вого и т.д.).

В спектрофотометрах участки спектра выделяют при помощи призм или дифракционных решеток, поэтому можно установить любую длину волны в заданном диапазоне. Обычно спектрофотометры - это при­боры более высокого класса, чем фотометры - в них можно выделить более узкий участок (более монохроматический) спектра, следовательно, точность измерения будет выше. Однако все зависит от конкретной конструкции прибора.

Чаще всего в клинической биохимии фотометрия проводится в области 400-700 нм – это, так называемая, видимая область спектра. Свет с большей длиной волны относится к ближней инфракрасной области, измере­ния в которой приходится делать чрезвычайно редко. Свет с длиной волны короче 400 нм относится к ультрафиолетовому диапазону, причем, разли­чают ближнюю область с длиной волны 300-400 нм и коротковолновый диапазон 220-300 нм.

Для фотометрических измерений в видимой и ближней инфракрас­ной областях применяются кюветы из обычного стекла. Для ближней ульт­рафиолетовой области нужны кюветы из специальных сортов стекла - увио­левые; в коротковолновой ультрафиолетовой области пригодны только кюветы из кварца или сапфира (высокой стоимости).

В биохимических лабораториях наиболее широко применяются фотоэлектроколориметры КФК, КМФЦ-2, БИАН-120 и др.; спектрофото-метры СФ-16, СФ-26 и их современные модифика­ции.

Принцип метода

Ф о т о м е т р и я - метод количественного анализа, основанный на измерении интенсивности поглощения или рассеяния веще­ством светового потока.

В основе этого метода лежит закон Бугера –Ламберта – Бера (1852), согласно которому существует прямо пропорциональная зависимость между концентрацией вещества в окрашенном растворе и степенью поглощения лучей света данным раствором. Интенсивность поглощения света зависит не только от количества и природы растворенного вещества, но и от толщины слоя раствора, длины волны падающего света, температуры раствора.

Степень поглощения света окрашенным раствором выражается оптической плотностью (экстинкцией), под которой понимают логарифм отношения интенсивности света, падающего на раствор, к интенсивности света, прошедшего через раствор.

Светопоглощение или э к с т и н к ц и я прямо пропорционально концентрации поглощающего вещества (другими словами - интенсивности окраски раствора, которая может быть изначаль­ной, то есть определяемое вещество обусловливает цвет раствора, либо приобретенной в процессе химической реакции), толщине слоя раствора и коэффициенту молярной экстинкции.

Коэффициент молярной экстинкции – величина поглощения, которую дает 1 моль вещества в 1 мл раствора при толщине слоя измеряемого раствора равной 1 см.

Величина оптической плотности обозначается буквой Е или D. Чем больше оптическая плотность, тем меньше света пропускает раствор. Для определения оптической плотности или светопропускания используют фотоэлектроколориметры.