3.4.3. Aр4 окаймление
Это окаймление было идентифицировано последним, его выявили на мембранах АГ, эндосом и транспортных везикул, осуществляющих сообщение между эндолизосомами и транс-Гольджи. Возможно, оно использует альтернативные М6PR-зависимому способы сортировки белков, путешествующих между указанными компартментами, что позволяет клетке расширить спектр грузов.
3.4.4. Сборка и разборка ар2-окаймления
Клатрин-зависимое АР2 окаймление работает на плазматической мембране, обеспечивая селективное поступление грузов, использующих в основном рецептор-опосредованный эндоцитоз. Формирующийся транспортный пузырек в этом случае называется «окаймленной ямкой», или ОЯ (coated pit). Поскольку, в отличие от ранее описанных окаймлений, обслуживающих «внутренние» транспортные пути, это окаймление осуществляет связь клетки с внешним миром, оно устроено сложнее, и в большей степени подвержено регуляции.
Первым «сюрпризом» является то, что до сих пор неизвестна инициирующая малая ГТФаза, работающая с этим окаймлением. Однако, какая-то ГТФазная активность вовлечена в его сборку, поскольку при введении в клетку негидролизуемого аналога ГТФ, ГТФ-γS, АР2 собирается не на плазматической мембране, а на поздних мультивезикулярных эндосомах.
Выдвигалась гипотеза, в соответствии которой инициатором сборки окаймления может служить сам груз, вернее, лиганд-рецепторный комплекс. Строго говоря, полностью эту возможность исключать нельзя, однако надежно установленный факт попадания в один и тот же АР2-окаймленный пузырек рецепторов с различной внутриклеточной судьбой (например, метаболического рецептора трансферрина и сигнальных рецепторных тирозинкиназ) противоречит этой идее. Возможно, на фоне потока конститутивно собирающихся ОЯ (а в клетках фибробластов возникает по 2–3 тыс. ОЯ в минуту), небольшой стимулированный каким-либо рецептором вклад будет и незаметен.
Известно, что для АР2 весьма существенна динамика актина. Действительно, плазматическая мембрана отличается от эндомембран еще и наличием слоя кортикального цитоскелета, который любому пузырьку необходимо преодолеть для дальнейшего поступления вглубь клетки. Оказалось, что на мембране существуют области, «разрешенные» для формирования окаймленных ямок (размером 5–10 диаметров ОЯ), именно в пределах такой области и может инициироваться сборка новых окаймлений. Актиновый цитоскелет играет большую роль в стабилизации таких «зон эндоцитоза».
Сборка АР2-окаймления начинается с появления в «разрешенной зоне» мембраны липида фосфатидил-4,5-инозитолдифосфата (PI-4,5-P2) в результате действия фермента фосфатидилинозитолкиназы. РI-4,5-P2 узнают молекулы синаптотагмина, который, в свою очередь, имеет сродство к АР2 (рис. 18).
(PI(4,5)P2)
Рис. 18. Инициация сборки окаймленной ямки
Одновременно на самом раннем этапе работают белки, которые определяют границу будущей территории инвагинации. Это АР180, имеющий самое высокое сродство к клатрину и, таким образом, работающий «затравкой» для новой решетки и вначале конкурирующий за клатрин с АР2.
Вторым ключевым игроком является эндофилин (endophilin). Этот белок обладает ацилтрансферазной активностью и способен модифицировать липид лизофосфатидную кислоту (LPA) – к его гидрофобному хвосту LPA добавляет остаток арахидоновой кислоты, обладающей менее упорядоченной структурой и большим диаметром. В результате мембрана в этом месте искривляется. Таким образом, начинается изменение кривизны мембраны формирующегося пузырька в области его границы.
В определение границ ОЯ вовлечен также комплекс «вспомогательных белков» (accessory proteins) Eps15/epsin, которые взаимодействуют с кортикальным актином и, что очень существенно, участвуют в сортировке груза, осуществляя своеобразный «фэйс-контроль». Параллельно с этими событиями к ямке привлекаются адапторные комплексы, за счет взаимодействия с ними накапливается груз. АР2 также рекрутируют из цитоплазмы клатриновые трискелионы, которые организуются в упорядоченную решетку. Каждую сторону гексамера организуют тяжелые цепи нескольких трискелионов. В среднем на 60 трискелионов в окаймленной везикуле приходится 20 адапторных комплексов.
Еще на стадии формирования, в состав растущей ОЯ включаются два белка, которые будут работать на последнем этапе формирования клатрин-окаймленной эндосомы ― амфифизин (amphyphisin) и динамин (dynamin). Этот комплекс и рекрутируются к «телу» пузырька благодаря сродству амфифизина к адаптинам. Динамин может взаимодействовать как с клатрином, так и с адаптинами и с фосфоинозитидами мембраны. По сути, он является ГТФазой, и далее мы подробно его охарактеризуем. Вначале он приходит на ОЯ в ГДФ-связанном виде, затем, по мере завершения сборки и увеличения кривизны мембраны динамин покидает комплекс с амфифизином, обменивает ГДФ на ГТФ и перемещается к горлышку уже почти сформированной везикулы. После гидролиза ГТФ динамин замыкает горлыщко, отшнуровывая окаймленную клатрином первичную эндосому от мембраны. Эта стадия называется фазой констрикции. Возможно, что дополнительный сигнал на отсоединение идет и с мембраны, поскольку одновременно фосфатаза синаптоджанин (synaptojanin) дефосфорилирует PI-4,5-P2, ликвидируя сайт инициации связывания синапотагмина.
Рис. 19. Цикл сборки АР2-окаймления
Также результатом дефосфорилирования этого липида является ослабление или прекращение взаимодействия с мембраной ряда белков окаймленной везикулы, в том числе динамина.
Как уже известно, клатрин обладает способностью к самосборке. Очевидно, что для снятия клатринового окаймления необходима затрата энергии, и поэтому в процесс разборки участвуют два белка – оксилин (auxilin) и шаперон Hsc70, или «раздевающая АТФаза» типа ААА (triple A). Разборка происходит очень быстро, поэтому в течение многих лет не удавалось выделить чистую фракцию клатрин-окаймленных первичных эндосом. Интересно, что оксилин способен взаимодействовать с динамином еще до фазы констрикции, а через него – и с Hsc70. Высказываются предположения, что энергия, выделяемая шапероном при гидролизе АТФ, может использоваться для реорганизации упаковки клатрина и переходу определенного числа гексамеров в клатриновой корзинке к пентамерам, что позволяет достичь практически идеальной шарообразной формы.
Кроме того, и после разборки шаперон может продолжать свою работу, оставаясь в комплексе с трискелионами и, таким образом, препятствуя их самопроизвольной агрегации в цитозоле. Однако, известно, что цитоплазматический пул клатрина состоит из фосфорилированных трискелионов, и, по-видимому, их фосфорилирует все тот же оксилин, являющийся протеинкиназой CGK (Cyclin G-associated kinase). При подавлении экспрессии оксилина в клетках наблюдали, произвольную самосборку пустых клатриновых корзиночек, несмотря на присутствие Hsc70. Кроме того, фосфорилированы и находящиеся в цитозоле адапторные комплексы. Возможно, роль фосфорилирования в сборке/разборке окаймлений до сих пор недооценена. Стоит вспомнить АР3 окаймление, в присутствии которого мембраны без клатрина искривляются столь же эффективно, как и в других случаях с клатрином. Работы последних лет все чаще демонстрируют участие протеинкиназ и фосфатаз в работе окаймлений, однако данные о координации, а также иерархии всех взаимодействий в ходе формирования окаймлений еще весьма отрывочны.
Как видно из приведенного описания, сборка клатрин-окаймленного пузырька включает несколько процессов, строго координированных во времени и локализации на самом пузырьке. Каким образом «оркеструется» вся эта масса событий, является одним из самых интригующих вопросов. Возможно, поиски ответа на этот вопрос следует искать в одной маленькой «подсказке», полученной из идентификации фуекциональных белков, взаимодействующих с адаптинами. Так, среди партнеров альфа-адаптина обнаруживаются АР180, Eps15 и epsin, amphiphysin и оксилин, т. е. белки, работающие последовательно. Самое интересное состоит в том, что эти белки связываются с одной и той же последовательностью «уха» альфа-адаптина. Учитывая то, что каждый из упомянутых белков имеет ряд «вторичных» эффекторов, взаимодействующих с ними посредством PRD-, EH-, NPF- и SH3-доменов, возникает возможность организовывать достаточно сложные регуляторные сети.