СЕЛЕКЦИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ВОЗДЕЙСТВИЕМ

МУТАГЕННЫХ ФАКТОРОВ И АДАПТАЦИЕЙ

Молочнокислые бактерии, обладающие производственно-ценными свойствами, например, высокой активностью свертывания молока, способностью образовывать диацетил, в природных источниках встречаются редко. Интенсифицировать сквашивание молока и улучшить качество кисломолочных продуктов можно при использовании молочнокислых бактерий с повышенной биохимической активностью. Получение таких штаммов осуществляется воздействием сильно действующих мутагенных факторов.

Популяция культуры состоит из большого числа клеток, различающихся по биохимической активности. Реакция клеток в ответ на воздействие внешних факторов неодинакова: одни клетки погибают, другие изменяют свои морфологические, биохимические и физиологические свойства. Эти особенности микроорганизмов обусловливают их изменчивость и позволяют получить разнокачественные особи с необходимыми свойствами. Воздействие мутагенных факторов состоит из двух основных этапов - воздействия на клетки микроорганизмов сильно действующего мутагенного фактора и последующего отбора высокоактивных вариантов. Этот метод селекции является высокоэффективным и доступным для практического использования при селекции промышленных штаммов.

Наследственные изменения (мутации) свойств микроорганизмов могут происходить под влиянием химических и физических факторов (ионизирующее излучение и ультрафиолетовые лучи). При радиационной селекции используют преимущественно гаммалучи и быстрые нейтроны, которые дают лучший мутагенный эффект. Однако их использование для получения промышленных штаммов ограничено. Ультрафиолетовые лучи с длиной волны 2650 нм обладают также хорошим мутагенным действием, так как лучи этой длины волны избирательно поглощаются молекулами ДНК. Ультрафиолетовые лучи вызывают возбуждение молекулы, что в последующем приводит к их химическому изменению.

Химические мутагены более эффективны по количеству мутаций, чем физические, и часто обладают более тонким и специфическим действием на клетку бактерии. Химические мутагены дают значительно больше полезных мутаций, чем физические, являясь в то же время менее летальными. В качестве химических мутагенов используют нитрозосоединения, формальдегид, уретан, этиленимин, окись этилена, диэтилсульфит, саркализин и др.

Применяют также сочетание физических и химических факторов.

Для получения мутантов различных видов молочнокислых бактерий используют нитрозосоединения, этиленимин, ультрафиолетовые лучи, гамма-лучи, рентгеновские лучи, быстрые нейтроны.

Селекция молочнокислых бактерий воздействием мутагенных факторов показана на схемах 1-3.

Для получения мутантов среди культур отбирают штаммы, популяция которых характеризуется средней изменчивостью, коэффициентом вариации от 10 до 20 %.

Схема 1. Селекция культур L.lactis воздействием мутагенных факторов

	Выращивание культуры на плотной или жидкой питательной среде
	Отделение и очистка клеток от среды
Воздействие на суспензию клеток этиленимином			Воздействие на суспензию клеток НЭМ*
Облучение суспензии клеток УФ-лучами			Высев суспензии клеток на плотную питательную среду
Высев суспензии клеток на плотную питательную среду			Термостатирование чашек с посевами
Термостатирование чашек с посевами			Выделение колоний и отбор мутантов
Выделение колоний и отбор мутантов

*−N-нитрозоэтилмочевина

Схема 2. Селекция культур L.cremoris воздействием мутагенных факторов

Выращивание культуры на плотной или жидкой питательной среде

Отделение и очистка клеток от среды

Воздействие на суспензию клеток НЭМ

Облучение суспензии клеток УФ-лучами

Высев суспензии клеток на плотную питательную среду

Термостатирование чашек с посевами

Выделение колоний и отбор мутантов

Схема 3. Селекция культур L.lactis subsp. acetoinicus воздействием мутагенных факторов

Выращивание культуры на плотной или жидкой питательной среде

Отделение и очистка клеток от среды

Воздействие на суспензию клеток N-нитрозометилмочевины или N-нитрозобиуретмочевины

Облучение суспензии клеток УФ-лучами

Высев суспензии клеток на плотную питательную среду

Термостатирование чашек с посевами

Выделение колоний и отбор мутантов

Для наращивания клеток используют гидролизованное молоко с добавлением 2,5 % дрожжевого автолизата или плотную питательную среду (2 % агара), приготовленную из гидролизованного молока (с 2,5 % дрожжевого автолизата), среды после стерилизации должны иметь рН 6,8-7,0 и быть прозрачными.

Комбинированное воздействие этиленимина и ультрафиолетовых лучей на штаммы L.lactis. Отобранные штаммы L.lactis (17-18 часовые, выращенные на стерильном обезжиренном молоке) засевают в гидролизованное молоко с дрожжевым автолизатом, термостатируют при оптимальной температуре роста в течение 17-18 ч. Полученную культуру наносят на скошенную плотную питательную среду, посевы термостатируют при оптимальной температуре. После этого клетки смывают с поверхности среды стерильным физиологическим раствором. Суспензию клеток помещают в стерильные центрифужные стаканчики (пробирки), которые закрывают полиэтиленовой пленкой, закрепляя ее резинкой. Стаканчики (пробирки) центрифугируют, сли­вают надосадочную жидкость, встряхивают осадок, добавляют сте­рильную дистиллированную воду и вновь центрифугируют. Такую операцию повторяют 2 раза. В результате получают клетки, отмытые от остатков среды. Из отмытых клеток в стерильной дистиллирован­ной воде готовят суспензию клеток, содержащую от 500 до 1000 тыс. клеток в 1 мл по стандарту мутности. Предварительно проверяют совпадаемость содержания клеток по стандарту мутности с данными, полученными при посеве на плотную питательную среду.

Среды, режимы термостатирования и центрифугирования при получении суспензии клеток приведены в табл.1.

Таблица 1

Условия для получения суспензии клеток

Операция	Среда	Термостатирование		Центрифугирование
		Температура,ºС	Продоолжительность,ч	Частота вращения центрифуги, с-1	Продолжительность, мин
Получение культуры	Гидролизованное молоко с 2,5 % дрожжевого автолизата	25 или 30	17-18	-	-
Наращивание клеток на плотной питательной среде	Агар с гидролизованным молоком или 2,5 % дрожжевого автолизата	25 или 30	17-18	-	-
Очистка клеток	Дистиллированная вода	-	-	313-523	10-15

При комбинированном воздействии этиленимина и ультрафиолетовых лучей вначале суспензию клеток подвергают действию этиленимина, а затем ультрафиолетовых лучей. Раствор этиленимина готовят на дистиллированной воде перед использованием. Для этого содержимое ампулы (0,1 мл) переносят в стерильную мерную колбу на 200 мл, добавляя дистиллированную воду до метки. Этот раствор имеет концентрацию 1:2000. Затем в стерильную пробирку отбирают 0,65 мл раствора этиленимина, 1,35 мл стерильной дистиллированной воды и 8 мл суспензии клеток. Получают концентрацию этиленимина в смеси 0,033 %. Смесь помещают в термостат, где выдерживают определенное время (табл.2).

Таблица 2

Режимы воздействия мутагенов на l.Lactis

Операция	Концентрация мутагена, %	Термостатирование			Центрифугирование			Продолжительность облучения УФ-лучами, с
		Температура, ºС	Продолжительность, мин	Частота вращения центрифуги, с-1		Продолжительность, мин
Воздействие этиленимина на суспензию клеток	0,033	30	60	-		-	-
Облучение суспензии клеток	-	-	-	-		-	15-45
Реактивация	-	18-22*	60	-		-	-
Воздействие N-нитрозоэтилмочевины	1	25 или 30	30-60	-		-	-
Снятие остаточного действия	-	-	-	313		10-15	-
Подращивание клеток	-	25 или 30	180	-		-	-

*Возможна выдержка при комнатной температуре на качалке.

Для снятия остаточного действия этиленимина смесь центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, клетки встряхивают и добавляют дистиллированную воду (10 мл). После перемешивания смесь помещают в чашки Петри (по 5 мл), которые устанавливают в бокс, где их открывают и облучают ультрафиолетовыми лучами (лампой БУВ-15 на расстоянии 30 см в течение 15-45 с). При облучении содержимое чашки перемешивают равномерным вращательным движением. Чашки с облученной суспензией закрывают светонепроницаемой бумагой и оставляют на 1 ч при комнатной температуре.

ют при оптимальной температуре роста в течение 17—18 ч. Получен* ную культуру наносят на скошенную плотную питательную среду, посевы термостатируют при оптимальной температуре. После этого клетки смывают с поверхности среды стерильным физиологическим раствором. Суспензию клеток помещают в стерильные центрифужные стаканчики (пробирки), которые закрывают полиэтиленовой пленкой, закрепляя ее резинкой. Стаканчики (пробирки) центрифугируют, сли­вают надосадочную жидкость, встряхивают осадок, добавляют сте­рильную дистиллированную воду и вновь центрифугируют. Такую операцию повторяют 2 раза. В результате получают клетки, отмытые от остатков среды. Из отмытых клеток в стерильной дистиллирован­ной воде готовят суспензию клеток, содержащую от 500 до 1000 тыс. клеток в 1 мл по стандарту мутности. Предварительно проверяют совпадаемость содержания клеток по стандарту мутности с данными, полученными при посеве на плотную питательную среду.

11ри комбинированном воздействии этиленимина и ультрафиоле- гоиых лучей вначале суспензию клеток подвергают действию этилен- нмина, а затем ультрафиолетовых лучей. Раствор этиленимина гото- иill на дистиллированной воде перед использованием. Для этого ( одержимое ампулы (0,1 мл) переносят в стерильную мерную колбу мн 200 мл, добавляя дистиллированную воду до метки. Этот рас- 1ми|> имеет концентрацию 1:2000. Затем в стерильную пробирку н|Пи|шют 0,65 мл раствора этиленимина, 1,35 мл стерильной дистнл- Лн|||жпн110й воды и 8 мл суспензии клеток. Получают концентрацию *I н 'ii'iiitMiiiia в смеси 0,033%. Смесь помещают в термостат, где вы- н |. I 11 п л ют определенное время (табл. 63).

Дли снятия остаточного действия этиленимина смесь центрифу-

По окончании выдержки делают глубинный или поверхностный посев суспензии клеток на плотную питательную среду. Разведение суспензии берут из расчета, чтобы на чашке выросло 10-20 колоний. Чашки с посевами выдерживают в термостате при оптимальной температуре в течение 3 сут, а затем дополнительно 1-2 сут при комнатной температуре.

От каждого штамма выделяют не менее 50-100 колоний (вариантов) в стерильное обезжиренное молоко, термостатируют при оптимальной температуре роста и отбирают вариант, свертывающие молоко не более чем за 24 ч, остальные отбраковывают. Отобранные варианты перевивают петлей в стерильное обезжиренное молоко 5-7 раз через 20-30 дней. При этом отбирают все варианты, свертывающие молоко не более 17 ч. Режим выделения и отбор вариантов после воздействия мутагенов приведены в табл. 3.

Таблица 3