Занятие №4

1. Тема: Лабораторное занятие по теме «Холестерин-Витал

Принцип метода:

При гидролизе эфиров холестерина холестеролэстеразой образуется свободный холестерин. Образовавшийся и имеющийся в пробе холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски при длине волны 500 (490-540) нм прямо пропорциональна концентрации общего холестерина в пробе.

Необходимые материалы и оборудование

1.Фотометр, полуавтоматический или автоматический анализатор длина волны 500 (490-540) нм.

2. Дозаторы со сменными одноразовыми наконечниками.

3. Вода дистиллированная или деионизованная.

4. Физиологический раствор.

5. Контрольные материалы с известным содержанием холестерин аттестованные данным методом.

Исследуемый материал (Образец)

Свежая сыворотка и плазма крови. В качестве антикоагулянта рекомендуется использовать гепарин, допустимо применение ЭДТА, фторида, оксалата. Для анализа следует использовать гемолизированные или хилезные образцы.

Процедура проведения анализа

Перед началом работы необходимо нагреть реагенты до выбранной температуры проведения анализа.

Количественный анализ:

Длина волны: 500нм (490-540)нм.

Длина оптического пути: 1см (5мм).

Температура инкубации: комнатная (18-25⁰С) или 37⁰ С.

Фотометрирование: против холостой пробы.

Внести в пробирки:	Опытная проба	Калибровочная проба	Холостая проба
Образец	0,02мл	-	-
Калибратор	-	0,02мл	-
Дистиллированная вода	-	-	0,02мл
Рабочий реагент	2,0мл	2,0мл	2,0мл

Пробы тщательно перемешать и инкубировать 5мин при 18-25⁰ С и 37⁰ С. Измерить оптическую плотность опытной (Е_оn) и калибровочной (Е_к) проб холостой пробы.

Окраска стабильна не менее часа после окончания инкубации и предохранении от прямого солнечного света.

Расчеты

Расчет концентрации холестерина проводят по формуле:

С = Е _on / Е_к х 5,17ммоль/л

Где:

Е _on – оптическая плотность опытной пробы, ед. опт. плот.

Е_к – оптическая плотность калибратора, ед. опт. плот.

5,17 ммоль/л – концентрация холестерина в калибраторе, моль/л

Примечание: Если концентрация холестерина в образце превышает 25ммоль/л, следует разбавить его физ. раствором, повторить анализ, результат умножить на фактор разведения.

Нормальные велечины

Нормальное содержание: < 5,2 ммоль/л (200мг/дл).

Пограничное содержание: 5,2-6,5 ммоль/л (201-250мг/дл).

Патологическое содержание: > 6,5 ммоль/л (251мг/дл).

Эти значения являются ориентировочными. Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон значений нормальных величин.

Триглицериды-Витал

Принцип метода:

Триглецириды ---^липаза → липаза + жирные кислоты:

Глицерин + АТФ—^{глицерокиназа} → глицерил- 3-фосфат+АДФ

Глицерил -3-фосфат + О₂ --- ^ГФО → диоксиацетон фосфат +2Н₂О₂

Н₂О₂ + 4 –ААР + 4- хлорфенол --- ^{пероксидаза} → хинонимин + 4 Н₂О₂

Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации триглицеридов в пробе.

Исследуемый материал:

Свежая сыворотка и плазма крови.

Аналитические характеристики набора

Линейность---------------------- до 700 мг/100мл (8ммоль/л)

Значение коэффициента вариации --------- не более 5%

Время инкубации ----------------- 20-25⁰С-10мин; 37⁰С -мин

Чувствительность ------------ 0,5ммоль/л

Стабильность окраски ------------------ не менее часа.

Рабочий реагент: Растворимое флакона №2 в 50мл буферного раствора (из флакона №1). Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать рабочий реагент после полного растворения лиофилизата при комнатной температуре 20-30мин. Полученный реагент стабилен не менее 6 месяцев при 2-8⁰С. Приобретаемое при хранении желтоватое или розоватое окрашивание является нормальным (до оптической плотности 0,200 против воды, кювета -1см) и не мешает определению триглицеридов. Калибратор готов к работе. Плотно закрывайте флакон сразу же после использования. Вскрытый калибратор стабилен в течение 3 месяцев при условии достаточной герметичности флакона.

Анализ

Внести в пробирки	Опытная проба, мл	Калибровочная проба,мл	Контрольная (холостая) проба,мл
Сыворотка или плазма	0,02	-	-
Вода	-	-	0,02
Рабочий реагент	2,0	2,0	2,0
Калибратор	-	0,02	-

Внимание: Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубирует не менее 10минут при комнатной температуре (20-25⁰С) или 5 минут при 37⁰С, и измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы в кюветах в толщиной поглощающего слоя 5мм (1см) при длине волны 505нм (ФЭК-490нм). Окраска стабильна не менее часа после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.

Расчет концентрации триглицеридов (С) производят по формуле:

С = (Е_on/ Е_кал х 250) -10 [мг/100мл] или С=(Е_on/Е_кал х2,85)- 0,11ммоль/л

Где Е_on и Е_кал –экстинкции опытной и калибровочной проб, измеренные относительно контрольной (холостой) пробы,

250мг/100мл (2,85ммоль/л)-концентрация триглицеридов в калибраторе,

10мг/100мл (0,11ммоль/л)- поправка на содержание свободного глицерина в сыворотке (плазме) крови.

Нормальные величины: 13-160мг/100мл (0,14-1,82ммоль/л)

Группа риска: 160-200мг/100мл (1,82-2,29 ммоль/л)

Патологические показатели: выше 200мг/100мл (более 2,29ммоль/л)

6. Литература: