Le travail 8. Le métabolisme des glucides l'expérience 1. La détermination quantitative de l'activité de l’amylase dans le sérum du sang

L'urine et le sérum du sang des gens sains possèdent l'activité basse de l’amylase en comparaison avec l’amylase du salive. La définition de l'activité de l’amylase dans l'urine et le sérum du sang est utilisée dans la pratique clinique au diagnostic des maladies du pancréas. À la pancréatite aiguë l'activité de l’enzyme dans le sang et dans l'urine augmente en 10-30 fois, à la pancréatite chronique, l'écrevisse du pancréas, la crise de la maladie des concrétions pierreuses – en 3-5 fois. À la violation de la fonction des reins, ainsi qu'à certaines maladies sanguines l'activité augmentée de l’enzyme dans le sang n'est pas accompagnée par l'augmentation de son activité dans l'urine.

L’enzyme l’amylase catalise l'hydrolyse de α-1,4-glycoside lien de l'amidon et du glycogène. La méthode est fondée sur la définition colorimétrique de la concentration de l'amidon avant et après l'hydrolyse enzymatique selon la peinture dans la réaction avec le réactif de Lugol. On fait le travail selon le tableau 2:

Le tableau 2

La détermination de l’activité de l’amylase

Les réactifs	La quantité du réactif, ml
	L’expérience	Le contrôle
La solution de l’amidon	1,0	1,0
Le serum du sang	0,02	–
	Incubir à 37 5 minutes
Le réactif de Lugol	1,0	1,0
L’eau distillé	8,0	8,0
Le serum du sang	–	0,02

On photométrie les deux solutions sur le photoélectronocolorimètre à 630 nm (l'épaisseur de la cuvette est 10 mm) relativement à l'eau. On fait le compte de l'activité de l’amylase selon la formule:

((D_c – D_exp.)/D_c)200,

où D_c – la densité optique de l'essai de contrôle, D_exp. – l'essai expérimenté.

L’expérience 2. La détermination quantitative de l’acide piruvique dans l'urine

L'acide piruvique (AP) est un des produits intermédiaires de métabolisme des hydrates de carbone. Dans les conditions anaérobes (à l'hypoxie) il se rétablit à l'acide lactique, et dans les conditions aérobes – subit à la décarboxylation oxydative et se transforme en acétyle-coA. (AP) – une des sources principales du glucogénese. Elle est le lien entre l'échange glucidique, lipidique et protéique. En conséquence d'une grande vitesse de la réaction de la transformation l'acide piruvique assiste dans les tissus et les liquides biologiques en petite quantité. Dans le sang son contenu fait 0,5-1 mg/100 ml du piruvate. Le contenu du piruvate dans l'urine dans la norme fait 2 mg/100 ml, son dégagement pour vingt-quatre heures avec l'urine – 10-25 mg.

L'augmentation la plus rude de la concentration du piruvate (AP) dans le sang s'enregistre au travail musculaire et В₁- de l'insuffisance de vitamines. À de grandes charges physiques la quantité de AP dans le sang peut augmenter jusqu'à 570 mcmol'/l, son dégagement avec l'urine augmente aussi. En outre ce phénomène s'enregistre aux maladies du parenchie, du foie, au diabète sucré, à la décompensation cordiale, toxicose etc. Pratiquement tous les facteurs provoquant l'augmentation de la concentration de l'acide dans les tissus (la tétanie, le tétanos, l'hypoxie de chacun genèse, les néoplasmes malins, l'hépatite aiguë etc.), en général, amènent à l'augmentation du niveau de AP dans le sang et, comme conséquence, dans l'urine.

Le principe de la méthode: le piruvate avec 2,4-dinitrophénylhydrazine forme la liaison peinte – 2,4-dinitrophénylhydrazonpiruvate. La dernière liaison du mélange réactif est extraite par le toluène. Dans le milieu alcalin en présence de la solution d'alcool de l'alcalin se développe la peinture rouge – orange dont l'intensité est proportionnelle directement à la quantité de AP.

Les étapes du travail: vers 1,0 ml de l'urine diluée en 3 fois, verser 0,5 ml de 0,1 % 2,4-dinitrophénylhydrazine, mélanger et dans 5 minutes ajouter 2,5 ml du toluène saturé de l'eau. Après la secousse pendant 1 minutes laisser la solution pour la stratification de l'eau et le toluène. De la couche supérieure toluène prendre l'essai par le volume 1 ml par le compte-gouttes sec gradué et transférer à l'éprouvette sèche, ajouter 3 ml de la solution d'alcool KОН. Travailler l'essai avec 1 ml de la solution standarde ainsi que l'essai expérimenté. Dans le contrôle sur les réactifs l'urine est remplacée par 1 ml de l'eau. Dans 10 minutes photométrirer les essais contre le contrôle sur les réactifs à la longueur d'onde 400-415 nm sur le photoélectrocolorimétre.

Le compte est passé selon la formule:

Х = (D₀50 mg/D_c)3,

où: D₀ – la densité optique de la solution expérimentée, D_с – la densité optique de la solution standarde, 50 mg – la concentration du standard de l’acide piruvique, Х – la concentration du piruvate dans l'urine.