Le travail 5. La détermination de l'activité des enzymes

1. L'action des activateurs et des inhibiteurs

sur α – amylase du salive

Dans la première éprouvette on verse 0,5 ml de 1 % de la solution du chlorure du sodium, à deuxième – 0,5 ml de 1 % de la solution du sulfate du cuivre, à troisième – 0,5 ml de l'eau distillée. À toutes les éprouvettes on ajoute selon 1 ml de 0,5 % de la solution de l'amidon et selon 1 goutte du salive dilué par l'eau (1:5). On mélange le contenu des éprouvettes par la secousse, on les place au thermostat aquatique avec la température 37 °С. Dans les intervalles à 1-2 minutes des éprouvettes on prend les essais et on fait avec eux la réaction avec la solution de l'iode dans l'iodure du potassium. On passe l'hydrolyse jusqu'au stade de l’érythrodextrine. On marque le temps (en minutes) les apparitions de l’érythrodextrine. On fait la conclusion sur l'action (l'activateur, inhibiteur) des additions étudiés.

2. La détermination de l'activité de α – amylase du salive selon Volguemoute

La méthode est fondée sur l'établissement de la dilution limite de la solution α-amylase pendant laquelle dans les conditions définies une désagrégation de la quantité donnée d'amidon jusqu'à l’érythrodextrine se réalise. On peut se servir de la méthode de Volguemoute pour la définition approximative de l'activité α – amylase dans le jus pancréatique, le sang, l'urine et d'autres liquides biologiques.

On place 1 ml du salive à l'éprouvette, on ajoute 9 ml de l'eau distillée et on mélange. On reçoit la solution du salive 1:10.

Dans 10 éprouvettes numérotées on verse selon 1 ml l'eau. À la première éprouvette on apporte 1 ml du salive dilué en 10 fois et on mélange par la voie de l'aspiration triple et l’évacuation du liquide du compte-gouttes. Puis on transfère 1 ml du liquide de la première éprouvette à la deuxième éprouvette en mélangeant le contenu, comme indiqué ci-dessus. 1 ml du liquide de la deuxième éprouvette on transfère à la troisième éprouvette et etc. De la dixième éprouvette après le melange 1 ml du liquide on éloigne.

À toutes les éprouvettes, à partir de dixième, on ajoute selon 2 ml de 0,1 % de la solution de l'amidon, on mélange le contenu. On place les éprouvettes au thermostat à 37 °С pour 30 minutes.

Dans 30 minutes on refroidit les éprouvettes et on ajoute à chacune selon 1 goutte de la solution de l'iode dans l'iodure du potassium. On marque l'éprouvette dans laquelle il y avait une désagrégation de l'amidon jusqu'à l’érythrodextrine donnant avec l'iode la peinture roux foncée. On exprime l'activité de α-amylase par la quantité de millilitres de 0,1 % de la solution de l'amidon qui peut désagréger 1 ml du salive non dilué à 37 °С pendant 30 minutes jusqu'au stade de l’érythrodextrine.

L'exemple: si la coloration roux foncée est marquée dans la quatrième éprouvette, où le salive est dilué en 160 fois, 1 ml du salive non dilué désagrégerait en 160 fois de la solution de l'amidon. Donc, 1 ml du salive non dilué désagrège en 30 minutes à 37 °С:

2160 = 320 ml 0,1% de la solution de l'amidon. Conventionnellement on accepte cela pour 320 unités de α-amylase selon Volguemoute:

А 37°/30' = 320 unités.

Les questions de contrôle

1. Qu'est-ce que c'est les activateurs et les inhibiteurs des enzymes?

2. Comment on peut étudier l'influence des activateurs et des inhibiteurs sur l'action de l’enzyme?

3. L’enzyme acétylcholinésthérase catalise l'hydrolyse de l'acétylcholine – du neuromédiateur, détachant dans les synaps des nerfs cholinérgetiques. Les produits de sa désagrégation – l'acétate et la choline – ne sont pas capables d'agir comme les neuromédiateurs. L'hydrolyse de l'acétylcholine s'interrompt par le calimine – la préparation médicale utilisée aux violations motrices après les traumas, les paralysies, dans la période de relèvement après la poliomyélite transférée, de l'encéphalite etc. L’inhibition de l’acétylcholinésthérase est reflétée par le chéma suivant:

Comparez les formules structurales de l’inhibiteur et du substrat. Pourquoi on peut supposer que l’inhibiteur se lie au centre actif de l’enzyme? Comment sous l'action du calimine changera la tenue de l'impulsion nerveuse (augmentera, diminuera, ne changera pas)?