5. Репликация днк

Репликация – процесс удвоения молекул ДНК. Он основан на следующих принципах:

1. Комплементарность – каждая дочерняя нить образуется по матрице, которой служит материнская нить.

2. Полуконсервативность – в каждой дочерней двойной спирали одна нить старая, т. е. половина материнской молекулы «законсервирована» в дочерней. Возможными моделями были также консервативная и дисперсионная (из фрагментов). В 1958 г. М. Мезелсон, Ф. Сталь и Д. Виноград доказали существование полуконсервативного механизма на основании опытов центрифугирования ДНК E.сoli, меченной изотопами ¹⁵N и ¹⁴N, в градиенте концентрации Cs Cl.

3. Антипараллельность. Две комплементарные нити синтезируются в противоположных направлениях. ДНК – полимераза III, которая осуществляет синтез новой цепи, движется по материнской нити только от 3' – конца к 5' – концу, т. е. синтез двух новых цепей идет в противоположных направлениях. Новая же нить наращивается всегда от 5' – к 3' – концу.

4. Прерывистость. Двойная спираль должна быть раскручена, чтобы сработала ДНК – полимераза, но вся огромная хромосома не может быть раскручена из одной точки, т.к. временные и энергетические затраты были бы слишком велики. Поэтому раскручивание и репликация начинается одновременно в нескольких местах, которые называются точками начала репликации (origin). На самом деле это не точки, а участки ДНК протяженностью 300 п. н., узнаваемые специфическими белками. Двойная цепь ДНК, начиная от локуса ori, разделяется на 2 цепи под действием фермента ДНК – геликазы (рвёт водородные связи). Процесс идет в двух противоположных направлениях с образованием двух репликационных вилок (между ними – репликационный глазок).

Образующиеся одинарные цепи стабилизируются SSB - белками, связывающими однонитевую ДНК (от англ. single – strand DNA – binding proteins), которые «садятся» на остовы цепей. Тетрамер этого белка связывается с участком ДНК протяженностью 32 нуклеотида. Более 200 молекул белка присутствует в каждой репликационной вилке.

Расхождение спирально закрученных цепей родительской ДНК обусловливает образование суперспиралей (супервитков) перед репликационной вилкой, это вызывает напряжение в молекуле ДНК и должно было бы приводить к скорой остановке процесса. Однако этого не происходит благодаря действию фермента ДНК – гиразы (относится к классу ДНК – топоизомераз). Он разрывает одну из цепей родительской ДНК, связываясь с ней ковалентно; далее происходит вращение обрывка этой цепи вокруг неразорванной второй цепи и снятие напряжения. После этого происходит отсоединение ДНК – гиразы и восстановление фосфодиэфирной связи разорванной цепи.

Синтез дочерних цепей ДНК осуществляет фермент ДНК – полимераза III; мономерами являются дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ), которые связываются друг с другом ковалентно и отдают в раствор (точнее, в кариоплазму) пирофосфат.

Однако ДНК – полимераза не может начинать синтез путем соединения двух первых нуклеотидов; она лишь может пришивать очередной дНТФ к 3' – ОН – концу уже имеющейся дочерней цепочки определенной длины, т. е. нужна некая «затравка». Поэтому репликационная вилка является асимметричной: из двух синтезируемых цепей одна («лидирующая») строится непрерывно, ее синтез идет быстрее, затравкой служит 3' – конец другой материнской цепи в точке начала репликации.

Другая цепь называется запаздывающей, или отстающей, т. к. она растет путем сборки из отдельных фрагментов, которые называются фрагментами Оказаки; их длина:

1000…2000 нуклеотидов у прокариот и

100…200 нуклеотидов у эукариот.

Фрагменты Оказаки синтезируются в «разрешенном» направлении (от 5' – к 3' – концу), но с участием РНК – затравок, или праймеров. Роль затравок выполняют короткие последовательности РНК (около 10 рибонуклеотидов), образующиеся на матричной цепи ДНК с помощью РНК – праймазы. Праймаза связывается с ДНК – геликазой и ДНК, образуя некий комплекс – праймосому, и синтезирует на отстающей цепи РНК – затравку. Эта затравка удлиняется за счет действия ДНК – полимеразы I, которая затем отделяется от ДНК.

После этого ДНК – полимераза III удаляет РНК – затравку и одновременно заполняет бреши ДНК - нуклеотидами. После замены всех нуклеотидов РНК на нуклеотиды ДНК остается разрыв между соседними фрагментами Оказаки, который «сшивается» ДНК – лигазой. Интересно, что отстающая цепь изгибается так, что ее ДНК – полимераза III образует комплекс с ДНК – полимеразой лидирующей цепи («модель тромбона»). Весь этот сложно организованный комплекс цепей нуклеиновых кислот и ферментов называют репликационной машиной, или реплисомой.

Скорость репликации:

~1000 нуклеотидов в секунду у прокариот,

~100 нуклеотидов в секунду у эукариот.

Участок ДНК между точкой начала репликации (ori) и точкой ее окончания (сайт терминации, ter) называется репликоном. Для терминации необходим специальный белок (продукт гена tus), который узнает последовательности ter и предотвращает дальнейшее продвижение вилки репликации.

У бактерий хромосома представляет собой один репликон, в эукариотической хромосоме имеются десятки репликонов.

В бактериальной клетке процесс синтеза ДНК ведут 15 разных ферментов, в эукариотической клетке их еще больше. Сложность и координированность процессов репликации ДНК обеспечивают точность воспроизведения генетической информации.

Исследовал механизмы репликации американский биохимик Артур Корнберг (р. 1918 г.), который в 1957 г. обнаружил у E.сoli фермент ДНК–полимеразу I. Получил Нобелевскую премию в 1959 г. за открытие механизма биосинтеза ДНК.