Тема 4. Биокатализ. Представление о ферментах

Ферменты - это катализаторы (в основном, белковой природы), ускоряющие химические реакции в живых клетках. Они обладают всеми свойствами, характерными для белков, и определенными особенностями строения, обусловливающими их каталитические свойства. Ферменты подчиняются общим законам катализа и обладают свойствами, характерными для небиологических катализаторов: ускоряют энергетически возможные реакции, не расходуются в процессе реакции.

Для ферментов характерны:

– специфичность. Биологическая функция фермента, как и любого белка, обусловлена наличием в его структуре активного центра, с которым взаимодействует определенный лиганд. Лиганд, взаимодействующий с активным центром фермента, называется субстратом.

–каталитическая эффективность. Большинство катализируемых ферментами реакций высокоэффективны, они протекают в 10⁸-10¹⁴ раз быстрее, чем некатализируемые реакции. Каждая молекула фермента способна за секунду трансформировать от 100 до 1000 молекул субстрата в продукт.

– конформационная лабильность. Каталитическая эффективность фермента, как и любой белковой молекулы, зависит от его конформации и, в частности, от конформации активного центра. В клетках имеются вещества, которые могут вызывать незначительные изменения конформации молекулы фермента за счет разрыва одних и образования других слабых связей; это может вызывать как повышение, так и снижение активности фермента.

Ферменты могут быть простыми или сложными белками. Большинство ферментов для проявления каталитической активности нуждается в присутствии некоторых веществ небелковой природы – коферментов.

Ионы металла участвуют в функционировании фермента различными способами.

Изменяют конформацию молекулы субстрата, что обеспечивает комплементарное взаимодействие с активным центром. Например, в качестве субстрата выступает комплекс Mg²⁺-АТФ.

Обеспечивают нативную конформацию активного центра фермента. Ионы Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Mo²⁺ участвуют в стабилизации активного центра ферментов и способствуют присоединению кофермента.

Стабилизируют конформацию белковой молекулы фермента. Например, для стабилизации четвертичной структуры фермента алкогольдегидрогеназы, катализирующей реакцию окисления этанола, необходимы ионы цинка.

Непосредственно участвуют в ферментативном катализе. Ионы Zn²⁺, Fe²⁺, Мn²⁺, Cu²⁺ принимают участие в электрофильном катализе. Ионы металлов с переменной валентностью могут также участвовать в переносе электронов. Например, в цитохромах (гемсодержащих белках) ион железа способен присоединять и отдавать один электрон. Благодаря этому свойству цитохромы участвуют в окислительно-восстановительных реакциях:

Коферменты являются органическими веществами, чаще всего производными витаминов, которые непосредственно участвуют в ферментативном катализе, так как находятся в активном центре ферментов. Фермент, содержащий кофермент и обладающий ферментативной активностью, называют холоферментом. Белковую часть такого фермента называют апоферментом, который в отсутствие кофермента не обладает каталитической активностью.

Кофермент может связываться с белковой частью фермента только в момент реакции или быть связанным с апоферментом прочными ковалентными связями. В последнем случае он называется простетической группой.

Активный центр ферментов – это определенный участок белковой молекулы, способный комплементарно связываться с субстратом и обеспечивающий его каталитическое превращение. Структура активного центра сформирована радикалами аминокислот, так же как и в случае активного центра любого белка. В активном центре фермента имеются аминокислотные остатки, функциональные группы которых обеспечивают комплементарное связывание субстрата (участок связывания), и аминокислотные остатки, функциональные группы которых осуществляют химическое превращение субстрата (каталитический участок) (рис. 14).

Рисунок 14. Схема строения активного центра фермента. Красным цветом отмечены аминокислоты, образующие активный центр фермента: 1 – участок связывания; 2 – каталитический участок

Специфичность – наиболее важное свойство ферментов, определяющее биологическую значимость ферментов. Различают субстратную и каталитическую специфичности фермента, которые определяются строением активного центра.

Под субстратной специфичностью понимается способность каждого фермента взаимодействовать лишь с одним или несколькими определенными субстратами.

Различают:

- абсолютную субстратную специфичность, если активный центр фермента комплементарен только одному субстрату. Например, расщепление мочевины уреазой.

- групповую субстратную специфичность, если фермент катализирует однотипную реакцию с небольшим количеством (группой) структурно похожих субстратов. Например, наличие пептидной связи: бактериальный фермент субтилизин специфичен к пептидной связи независимо от строения образующих ее аминокислот, пепсин катализирует разрыв пептидной связи, образованной аминогруппами ароматических аминокислот, тромбин расщепляет пептидную связь только между аргинином и глицином. Или наличие ОН-группы: алкогольдегидрогеназа окисляет до альдегидов одноатомные спирты (этанол, метанол).

- стереоспецифичность, если фермент проявляет абсолютную специфичность только к одному из существующих стереоизомеров субстрата. Например, специфичность к L- или D-аминокислотам: почти все ферменты человека взаимодействуют с L-аминокислотами, или специфичность к цис- и транс-изомерам: аспартаза реагирует только с транс-изомером – фумаровой кислотой, но не с малеиновой кислотой (цис-изомер).

Каталитическая специфичность, или специфичность пути превращения субстрата, обеспечивает преобразование одного и того же субстрата под действием разных ферментов. Это обеспечивается строением каталитических участков активных центров соответствующих ферментов. Например, молекула глюкозо-6-фосфата в клетках печени человека является субстратом четырех различных ферментов: фосфоглюкомутазы, глюкозо-6-фосфатфосфатазы, фосфоглюкоизомеразы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Однако за счет особенностей строения каталитических участков этих ферментов происходят различные превращения глюкозо-6-фосфата с образованием четырех различных продуктов (рис. 15).

Рисунок 15. Каталитические пути превращения глюкозо-6-фосфата

Механизм действия ферментов

В ходе катализа субстрат, связанный с активным центром фермента в фермент-субстратный (ES) комплекс, претерпевает химическое превращение в продукт, который затем высвобождается. Схематично процесс катализа можно представить следующим образом:

E + S  ES  EP  E + P,

где E – фермент (энзим), S – субстрат, P – продукт реакции.

Процесс ферментативного катализа условно можно разделить на этапы (рис. 16). На этапе I происходит сближение и ориентация субстрата в области активного центра фермента. На этапе II в результате индуцированного соответствия [изменение конформации субстрата (S) и активного центра фермента] образуется фермент-субстратный комплекс (ES). На этапе III происходит дестабилизация связей в субстрате и образование нестабильного комплекса фермент-продукт (ЕР). На этапе IV происходит распад комплекса (ЕР) с высвобождением продуктов реакции из активного центра и освобождением фермента.

Рисунок 16. Этапы ферментативного катализа:

I - этап сближения и ориентации субстрата в активном центре фермента;

II - образование фермент-субстратного комплекса (Ев);

III - образование нестабильного комплекса фермент-продукт (ЕР);

IV - высвобождение продуктов реакции из активного центра фермента

Для понимания энергетики химической реакции необходимо учитывать изменение энергии субстратов и продуктов реакции, а также роль ферментов в этом процессе. Известно, для того чтобы прошла реакция, субстраты должны получить такое количество дополнительной энергии (называемой энергией активации Е_а), которое необходимо для вступления молекул субстрата в реакцию (рис. 17). В случае ферментативной реакции происходит снижение энергии активации, что обеспечивает более эффективное протекание реакции.

Рисунок 17. Изменение свободной энергии в ходе химической реакции

Фермент понижает энергию активации Е_а, т.е. снижает высоту энергетического барьера; в результате возрастает доля реакционно-способных молекул и повышается скорость реакции

Классификация и номенклатура ферментов

Современные классификация и номенклатура ферментов разработаны Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и утверждены на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г. в Москве.

В основу классификации легли 3 принципа: химическая природа фермента; химическая природа субстрата, на который действует фермент; тип катализируемой реакции.

Согласно современной классификации, ферменты делят на шесть классов.

1 . Оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции:

Подкласс оксидоредуктаз – дегидрогеназы, катализирующие реакции дегидрирования.

Наиболее распространены дегидрогеназы, содержащие в качестве активной группы никотинамидадениндинуклеотид (НАД⁺), никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД).

2. Трансферазы – ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов.

Фосфотрансферазы- перенос остатка фосфорной кислоты. Фосфорные эфиры органических соединений обладают повышенной химической активностью. Донором фосфатных остатков в большинстве случаев является АТФ.

А минотрансферазы ускоряют реакцию переноса аминогруппы от аминокислоты на a-кетокислоту (реакции трансаминирования).

Протеинкиназы ускоряют перенос остатка фосфата с АТФ на белки, изменяя их биологическую активность. Ацилтрансферазы катализируют перенос ацилов (остатков кислот).

3. Гидролазы – ускоряют реакции гидролиза (при участии воды). При этом продукты реакции имеют более простое строение, чем субстрат. Подклассы гидролаз: эстеразы, фосфатазы, гликозидазы, пептидазы.

Эстеразы катализируют гидролиз сложных эфиров спиртов с органическими и неорганическими кислотами. Например, липаза ускоряет гидролиз триацилглицеринов (жиров):

Фосфатазы катализируют гидролиз фосфорных эфиров:

глюкозо-6-фосфат + Н₂О ® глюкоза + Н₃РО₄

Г ликозидазы катализируют гидролиз гликозидов. Из гликозидаз, действующих на полисахариды (крахмал, гликоген), наиболее известны амилазы, сахарозу гидролизует сахараза, лактозу – лактаза,

мальтозу – мальтаза.

Пептидгидролазы (пептидазы) ускоряют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах: пепсин, трипсин, химотрипсин, эластаза, карбоксипептидаза.

4 . Лиазы – ферменты, катализирующие разрыв связей С–О, С–С, С–N и других, а также обратимые реакции отщепления - присоединения различных групп от субстратов негидролитическим путем. Эти реакции сопровождаются образованием двойной связи и выделением таких простейших продуктов, как СО₂, H₂O, NH₃ и т.д. Реакции декарбоксилирования катализируют декарбоксилазы; дезаминирования – дезаминазы.

5 . Изомеразы - ферменты, катализирующие взаимопревращения структурных, оптических и геометрических изомеров.

6. Лигазы (синтетазы) - ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ либо других веществ.

Одной из важнейших карбоксилаз является пируваткарбоксилаза:

Отличия ферментов от небиологических катализаторов заключаются в том, что скорость и селективность ферментативных реакций выше; ферменты обладают высокой специфичностью; скорость ферментативной реакции может регулироваться.

Повышение температуры до определенных пределов оказывает влияние на скорость ферментативной реакции подобно тому, как влияет температура на любую химическую реакцию: с увеличением температуры повышается скорость ферментативной реакции. Однако скорость ферментативной химической реакции имеет свой температурный оптимум, превышение которого сопровождается понижением ферментативной активности, что связано с термической денатурацией белковой молекулы (рис. 18). Для большинства ферментов человека оптимальной температурой является 37-38 °С.

Рисунок 18. Зависимость скорости ферментативной реакции (V) от температуры

Активность ферментов зависит от рН раствора, при котором протекает ферментативная реакция. Влияние рН на активность ферментов обусловлено изменением ионизации функциональных групп аминокислотных остатков данного белка и субстрата, обеспечивающих оптимальное образование фермент-субстратного комплекса. Для каждого фермента существует значение рН, при котором наблюдается его максимальная активность (рис. 19).

Рисунок 19. Зависимость скорости ферментативной реакции (V) от рН среды

 Широкое применение в медицинской практике ферменты находят в качестве диагностических (энзимодиагностика) и терапевтических (энзимотерапия) средств. Ферменты также используются в качестве специфических реактивов для определения ряда метаболитов. Например, фермент глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови; фермент уреазу используют для оценки содержания в биологических жидкостях мочевины; с помощью различных дегидрогеназ выявляют наличие соответствующих субстратов, например пирувата, лактата, этилового спирта и т.д.

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека.

Принципы энзимодиагностики основаны на следующих закономерностях:

- в норме в сыворотке крови содержатся ферменты, выполняющие специализированные функции, например, участвующие в свертывающей системе крови. Клеточные ферменты практически не проникают из неповрежденных клеток в кровь. В минимальных количествах некоторые ферменты клеток могут определяться в крови;

- при повреждении мембран клеток (воспаление, некроз) в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается количество внутриклеточных ферментов поврежденных клеток, активность которых можно зарегистрировать специальными биохимическими тестами;

- для энзимодиагностики используют ферменты, имеющие преимущественную или абсолютную локализацию в определенных органах(органоспецифичность);

- количество высвобождаемого фермента должно быть пропорционально степени повреждения ткани и достаточно для определения его активности;

- активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, отличается от нормальных значений и стабильна в течение достаточно длительного времени (сутки);

- появление в плазме крови ферментов, имеющих только цитозольную локализацию, свидетельствует о воспалительном процессе; при обнаружении митохондриальных или ядерных ферментов можно говорить о более глубоких повреждениях клетки, например некрозе.

Ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но с разной первичной структурой белка, называют изоферментами. Они отличаются друг от друга кинетическими параметрами, условиями активации, особенностями связи апофермента и кофермента. Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты или их субъединицы. На различиях в физико-химических свойствах и основаны методы определения изоферментов. Изоферменты часто являются органоспецифичными, так как в каждой ткани содержится преимущественно один тип изоферментов. Следовательно, при повреждении органа в крови появляется соответствующая форма изофермента. Обнаружение определенных изоферментных форм ферментов позволяет использовать их для диагностики заболеваний.

Например, фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты). Лактатдегидрогеназа – олигомерный белок с мол. массой 134 000, состоящий из четырех субъединиц двух типов – М (от англ. muscle – мышца) и Н (от англ. heart – сердце). Комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования пяти изоформ лактатдегидрогеназы (рис. 20, А). ЛДГ₁ и ЛДГ₂ наиболее активны в сердечной мышце и почках, ЛДГ₄ и ЛДГ₅ – в скелетных мышцах и печени. В остальных тканях имеются другие варианты этого фермента. Изоформы ЛДГ различаются друг от друга электрофоретической подвижностью, что позволяет устанавливать тканевую принадлежность изоформ ЛДГ (рис. 20, Б). Для диагностики заболеваний сердца печени и мышц необходимо исследование изоформ ЛДГ в плазме крови методом электрофореза. На рис. 20 В представлены электрофореграммы плазмы крови здорового человека, больного инфарктом миокарда и больного гепатитом. Выявление в плазме крови тканеспецифических изоформ ЛДГ широко используется в качестве диагностического теста.

Рисунок 20. Изоформы лактатдегидрогеназы:

А - строение различных изоформ ЛДГ; Б - распределения на электрофореграмме и относительные количества изоформ ЛДГ в различных органах; В - содержание изоформ ЛДГ в плазме крови в норме и при патологии (электрофореграммы - слева и фотометрическое сканирование - справа)

Энзимодиагностика используется для установления диагноза при заболеваниях различных органов. Набор анализов зависит от возможностей конкретной биохимической лаборатории и постоянно совершенствуется. Наиболее распространены следующие энзимодиагностические тесты:

- при заболеваниях сердца (инфаркт миокарда) – лактадегидрогеназа, креатинкиназа, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза. Одним из первых при инфаркте миокарда в крови появляется белок тропонин;

- при заболеваниях печени – аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, ацетилхолинэстераза, гамма-глутамилтранспептидаза. При заболеваниях поджелудочной железы – панкреатическая амилаза, липаза;

- при заболеваниях простаты – кислая фосфатаза.

Применение ферментов в качестве лекарственных препаратов активно развивают в следующих направлениях:

– заместительная терапия – использование ферментов в случае их недостаточности;

– элементы комплексной терапии – применение ферментов в сочетании с другой терапией.

Заместительная энзимотерапия эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков. Например, пепсин используют при гастритах со сниженной секреторной функцией. Дефицит панкреатических ферментов также в значительной степени может быть компенсирован приемом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, мезимфорте и др.).

В качестве дополнительных терапевтических средств ферменты используются при ряде заболеваний. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин) применяют при местном воздействии для обработки гнойных ран с целью расщепления белков погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Ферментные препараты рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза используются в качестве противовирусных препаратов при лечении аденовирусных конъюнктивитов, герпетических кератитах.

Ферментные препараты стали широко применяться при тромбозах и тромбоэмболиях для разрушения тромба. С этой целью используют препараты фибринолизина, стрептолиазы, стрептодеказы, урокиназы.

Фермент гиалуронидазу (лидазу), катализирующий расщепление гиалуроновой кислоты, используют подкожно и внутримышечно для рассасывания спаек и рубцов после ожогов и операций.

Фермент аспарагиназа (разрушает аминокислоту Асн в крови) используется при онкологических заболеваниях крови, ограничивая поступление аминокислоты Асн в опухолевые клетки. Лейкозные клетки не способны к самостоятельному синтезу этой аминокислоты, поэтому снижение ее содержания в крови нарушает рост этих клеток.

В основе многих заболеваний лежит нарушение функционирования ферментов в клетке – так называемые энзимопатии. Различают энзимопатии первичные (наследственные) и вторичные (приобретенные). 

При первичных энзимопатиях дефектные ферменты наследуются в основном, по рецессивно-аутосомному типу. При этом нарушается метаболический путь, содержащий дефектный фермент. Развитие заболевания в этом случае может происходить по одному из «сценариев»:

– нарушается образование конечных продуктов, что вызывает недостаток определенных веществ (например, при альбинизме не вырабатывается пигмент в клетках кожи);

– накапливаются субстраты-предшественники, оказывающие токсическое действие на организм (например, при алкаптонурии накапливается промежуточный метаболит – гомогентезиновая кислота, которая откладывается в суставах, вызывая в них воспалительные процессы).