17 Чашечный метод

Чашечный метод является одним из первых количественных методов в истории микробиологии. Перед посевом исследуемый образец разводят стерильной водопроводной водой. Для этого 1 г полуфабриката размешивают в стерильном сосуде (фарфоровая чашечка, химический стаканчик) с 9 мл стерильной воды и переносят в стерильную пробирку. После тщательного размешивания 1 мл исходного разведения (1: 10) переносят, стерильной пипеткой в следующую пробирку с 9 мл стерильной воды (1: 100) и т. д. до разведения 105-108

Выбор степени разведения зависит от предполагаемой обсемененное продукта и цели анализа. Нужно, чтобы на чашках вырастало не менее 10 и не более 300 колоний. Посев производят из выбранного разведения (обычно 104-107) или путем глубинной заливки (для учета общего количества молочнокислых бактерий), или поверхностным посевом (для учета только дрожжей). В первом случае 1 мл суспензии вносят в стерильную чашку Петри и заливают 10 мл расплавленного сусло-агара (12% СВ) с мелом. Путем осторожного покачивания чашки среда перемешивается с микробной суспензией.

После застывания агара чашки переворачивают вверх дном (чтобы конденсационная вода не скапливалась на поверхности агара и не дала роста микроорганизмов в виде сплошного газона). Выращивают чашки при оптимальной для данного вида бактерий температуре (30-35°С) в течение 48 ч. Выросшие колонии молочнокислых бактерий учитывают по зонам растворения мела вокруг колоний.

При поверхностном посеве чашки Петри предварительно заливают 10-15 мл сусло-агара (8% СВ) без мела. После застывания агаровой пластинки ее подсушивают в термостате. Затем наносят на поверхность среды 0,1 мл исследуемой суспензии и распределяют по всей площади стерильным шпателем Дригальского. Рекомендуется растирать пробу в течение 1 мин, чтобы на шпателе не осталось посевного материала. Затем чашки также переворачивают вверх дном и выращивают в термостате двое суток при 30°С.

Подсчитав количество выросших колоний на чашке Петри, делают пересчет количества микробов в 1 мл среды, учитывая разведение образца. Обычно посевы делают параллельно на 2 чашки Петри, а затем выводят среднеарифметическое.

Для подсчета выросших колоний можно использовать счетные пластинки Вольфлюгеля или электрические счетчики. Колонии подсчитывают через увеличительное стекло. Каждая колония регистрируется автоматически, когда к ней прикасаются электрической иглой.

Чашечный метод в отличие от прямого подсчета клеток позволяет учитывать только живые, неослабленные клетки микробов. Он имеет ряд принципиальных ошибок: нет уверенности, что выросшие колонии образуются во всех случаях из одной клетки; микроорганизмы неравномерно распределены во взвеси и дают сплошной рост на отдельных участках чашки Петри; не каждая живая клетка способна дать рост колонии; не существует универсальной среды, на которой росли бы все группы микроорганизмов, находящиеся в образце.

Кроме того, чашечный (метод достаточно трудоемкий, громоздкий и дорогостоящий. При массовых анализах он требует много стерильной посуды, питательных сред, времени на подготовку и выполнение анализов. Для получения результатов анализа нужно не менее 48 ч.

Все это затрудняет применение его на производстве, особенно на тех заводах, где нет хорошо оснащенных лабораторий.

За рубежом при микробиологических исследованиях применяют чашки Петри и пипетки из полистирола для одноразового употребления. Они вырабатываются специальными фабриками и рассылаются стерильными в мешочках из полимерного материала. Использование такой посуды значительно облегчает работу микробиолога, так как отпадает необходимость мыть и стерилизовать посуду.

Другим путем улучшения чашечного метода является применение готовых стандартных сухих сред. Промышленное изготовление таких сред, в частности сусло-агара, налажено в Чехословакии. В нашей стране сухие питательные среды (сухой питательный агар) выпускает Дагестанский институт питательных сред в Махачкале (г. Махачкала, ул. Леваневского, 24) и завод химических реактивов в г. Олайне Латвийской ССР. Здесь изготовляют дрожжевой автолизат, сухой дрожжевой экстракт и гидролизат казеина. Однако набор выпускаемых сред невелик, поэтому давно возникла необходимость строительства завода стандартных питательных сред. Выпуск наборов реактивов для идентификации отдельных групп бактерий будет организован Ереванским заводом химических реактивов.

При работе с основными видами бродильной микрофлоры заквасок и теста приходится пользоваться нестандартными питательными средами. Для выделения дрожжей чашечным методом готовят солодовое сусло 8% СВ с 2% агара, для молочнокислых бактерий - агаризованное солодовое сусло (12% СВ) с добавлением мела или сложную по составу среду МРС-4 с сорбиновой кислотой.