6. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

ИПСК (iPS-Induced Pluripotent Stem Cells) - ПСК, полученные из соматических клеток взрослого организма в результате трансфекции специфическим ограниченным набором генов (перепрограммирование клеток путем введения транскрипционных факторов).

Характеристика СК (в целом): неспециализированные, самовозобновление в течение долгого времени, в опред условиях могут быть индуцированы для превращения в специализированные клетки.

СК во взрослом организме: немного, в строго определенных местах (напр, костный мозг), источник для пополнения популяции дифференцированных клеток.

Плюрипотентные клетки (в прямом пути происходят от тотипотентных клеток) - могут дифференцироваться в любой из 3 зародышевых слоев. 

iPS-клетки практически идентичны ЭСК (эмбриональным, из бластоцисты) по морфологии, ростовым свойствам, экспрессии специфич маркеров ЭСК, местам метилирования хроматина, времени удвоения, формированию эмбриоидных тел (образующиеся после помещения клеток в культуру), формированию тератом, формированию жизнеспособных химер (клеток исходного родительского генотипа и iPS-клеткок) и способности дифференцироваться.

Различия: ЭСК - из бластоцисты, ИПСК– из клеток взрослого организма (в т.ч. от пациентов с заболеваниями – пациентоспецифичность). «-» ЭСК– возможное развитие иммунного ответа на трансплантат.

Схема получения - репрограммирование соматич клеток в ПСК:  1 - изолирование и культивирование донорных клеток 2 - трансфекция ассоциированных со стволовой клеткой генов в донорные клетки 3 - сбор и культивирование клеток, используя митотически неактивированные фидерные клетки (для опоры и питания ПСК) 4 - небольшое количество клеток становятся iPS-клетками («стираются» дифференцировочные сигналы, полученные в ходе развития клетки, заново приобретают возможность к дифференцировке в различных направлениях) и генерируют подобные эмбриональным колонии стволовых клеток. 

(5 – дальнейшая дифференцировка в клетки различных типов)

Предыстория: 1935 - идея «пересадки» ядер дифференцированных клеток в цитоплазму яйцеклетки, чтобы изучить способность к дифференциации.

1962 - пересадка ядра эпителиальной клетки взрослой лягушки в икринку, лишенную клеточного ядра, успешно дает начало нормальному головастику и взрослой лягушке.

Первые ИПСК мыши - 2006 г. Лаб-я Яманаки (Япония) нашла несколько десятков генов, поддерживающих в ЭСК программу плюрипотентности, активность которых намного выше, чем в дифференцированных клетках. Внедрили в фибробласт вектор с 24 генами, заставившими часть клеток дать колонии, подобные СК, по одному удаляли гены и установили 4 гена, необходимых и достаточных для «перепрограммирования» клетки - «коктейль» Яманаки: с-Myc, Oct3/4, Sox2 и Klf4.

Однако сначала не удалось получить жизнеспособные химерные организмы при введении этих iPS-клеток в эмбрионы.

ИПСК получались с крайне низким выходом, однако даже этого достаточно для неограниченно делящихся клеток. Далее - оптимизация состава перепрограммирующих факторов и способов введения вектора для повышения эффективности перепрограммирования и снижения вероятности опухолеобразования. (Пример: Нейрональные стволовые клетки мыши превращаются в ИПСК введением одного только фактора Oct4). ИПСК можно получить, используя не только «коктейль» Яманаки, можно заменять на некоторые другие.

2007 – жизнеспособная химерная мышь.

Зрелые клетки могут быть „перепрограммированы“ обратно в плюрипотентное состояние - Нобелевская по физиологии и медицине (2012, Джон Гардон, Шинья Яманака).

Способы получения ИПСК:

-вирусные системы индукции: ретровирусная, лентивирусная трансдукция (не применяется в клет терапии из-за опасности активации трансгенов в организме и вероятности развития злокачественных заболеваний. Встраиваются в произвольное место генома, могут повредить или запустить программу онкологической трансформации. Эфф-ть – 0,1%). Вирус Сендай из семейства Paramyxoviridae, содержащий одноцепочечную РНК, не интегрирует в геном, его можно удалить, проинкубировав ИПС клетки при температуре 39 С. Полностью репрограммированные клетки обычно получают через 25 дней после инфекции. Эффективность репрограммирования сильно варьирует для разных типов клеток.

-безвирусные методы индукции плюрипотентности: piggyback транспозон, несущий транскрипционные факторы Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, слитые через 2А пептиды, плазмидные ДНК, рекомбинантные транскрипционные факторы (система транспозон-транспозаза (эфф-ть 0,1-1%) предполагает внесение 2 двунитиевых разрывов при встраивании и при удалении, а репарация может происходить с ошибками и мутациями. Репрограммирование неинтегрирующимися векторами и белками – очень низкая эффективность – тысячные доли %).

-индукция ПП с помощью трансфекции соматических клеток мРНК факторов репрограммирования (безопасно, так как Мрнк полностью разрушается в клетке, а ее синтез in vitro не связан с использованием животных материалов. Эффективность – 2%).

«Малые молекулы»: ингибиторы ДНК-метилтрансферазы, метилазы и деацетилазы гистонов, Bayak8644 (активатор кальциевых каналов) повышают эфф-ть репрограммирования в несколько раз, т.к. оно связано с эпигенетическими перестройками.

Необходимым условием эффективного репрограммирования является подавление активности белкового комплекса ремоделирования нуклеосом и деацетилирования – NuRD, экспрессия которого наблюдается во всех типах соматических клеток (ингибирует гены плюрипотентности).

Экспрессия гена Nanog характерна для недифф клеток и является маркером плюрипотентного состояния. Повышенная экспрессия гомодимера белка в ЭСК мыши способствует сохранению недиф состояния.

Источники получения ИПСК: фибробласты кожи (популярно, удобно), нейральные СК (из головного и спинного мозга), эндотелий, кератиноциты кожи (удобно), терминально дифференцированные лимфоциты, гепатоцит, эпителий желудка, волосяных фолликул (удобно), слизистой глаза, мононуклеарных клеток периферической крови.

Процесс репрограммирования у фибробластов: через 3 дня после вирусной инфекции - замолкание фибробласто-специфичных генов с одновременной активацией экспрессии генов, характерных для ЭСК. Удаление репрессивных эпигенетических меток из ключевых генов плюрипотентности и ремоделирование участков хроматина, где находятся гены плюрипотентности. Спустя 10–15 дней - детектируется эндогенная экспрессия Oct4, Sox2 и Nanog, реактивация теломеразы и инактивация Х хромосомы, постепенное замолкание трансгенов.

Помимо ремоделирования клеток через ИПСК, существует процесс трансдифференцировки — превращению одного типа клеток в другой, минуя стадию СК. (фибробласты в миобласты - активация гена MyoD. экзокринные клетки поджелудочной железы в эндокринные, мезодермальные фибробласты в эктодермальные нейроны).

Перспективы использования ИПСК:

- терапевтическое применение ИПСК (лечение заболеваний крови и иммунной системы (в т.ч. генетические), онкологии, бол-ни Паркинсона и Альцгеймера, слепоты, нарушений работы спинного мозга, диабет, ИМ и мн. др. – связаны с гибелью или дисфункцией клеток организма);

- позволяет получать плюрипотентные СК без использования эмбрионов;

- чрезвычайно информативная модель различных наследственных и врожденных заболеваний человека, в т.ч. нейродегенеративных (изучение молекулярных и клеточных основ тяжелых болезней человека in vitro);

-решение проблемы иммунной несовместимости (трансплантология);

-возможность получать линии бессмертных клеток, соответствующих редким генетическим заболеваниям, изучать болезнь и действие ЛС (тест-ситемы для скрининга ЛС in vitro, учитывая индивидуальные особенности пациента), создание банка клеток;

- замещение больных или утраченных клеток прямо в ткани (в перспективе);

- сокращение экспериментов по тестированию новых соединений на клетках животных.

Проблемы, сложности:

- безопасность: ИПСК могут быть онкогенными (в частности, ген с-Myc);

- эффективность репрограммирования (низкий «выход»), сложность обеспечения жизнеспособности клеток после пересадки человеку (клетки могут не прижиться, вызвать иммунный ответ), правильное встраивание.