Перечень вопросов:
Основы стерильной работы с культурами клеток. Оборудование для культуральной лаборатории.
Принципы разработки сред для культивирования клеток. Бессывороточные среды и среды определенного химического состава.
Получение первичных культур. Примеры суспензионных и прикрепленных культур, которые могут быть использованы в терапии
Получение клеточных препаратов: выделение из тканей и манипуляции in vitro.
Обогащение и очистка клеточных препаратов. Иммуноселекция, селективное культивирование
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.
Клеточная терапия неврологических заболеваний
Механизмы терапевтических эффектов клеточных препаратов
Цели и подходы к применению клеточных технологий в кардиологии.
Основные задачи и принципы тканевой инженерии
Требования, предъявляемые к клеточным препаратам. Клеточный паспорт.
Проблемы получения клеточных препаратов на основе стволовых клеток.
Способы введения клеточных препаратов в ткани и орган
1.Основы стерильной работы с культурами клеток. Оборудование для культуральной лаборатории. Оборудование
культуральной лаборатории |
Помещение культурального блока: предбоксник (серый цвет) и бокс (зеленый) 1 - СО2-инкубатор 2 - холодильник с реагентами, растворами 3 - ламинар 4 - стол с микроскопами: световым (6) и инвертированным световым (7) 5 - шкаф с стерильная посудой |
При выращивании клеток в посуде типа чашек Петри и пластиковых планшетов клеткам необходим СО2 (5%), - СО2-инкубаторе. При культивировании клеток в сосудах Карреля, заткнутых пробками, СО2 не нужен, и его отключают.
Прибор способен поддерживать определенную температуру (это термостат), которую можно задавать исходя из условий эксперимента. Так, например, для роста и развития клеточной культуры обязательным условием является температура 37o С. ламинар - место, где производятся все манипуляции с клетками, то есть это собственно рабочее место экспериментатора.
|
|
Справа в углу находится стакан с пинцетами, автоматическими пипетками, скальпелями. С правой стороны находятся пенал со стеклянными пипетками, резиновая груша и стакан со спиртом.
Слева расположена стерильная упакованная в фольгу посуда и приспособления для работы с клетками (наконечники, пробки, фильтры).
Ближе к центру стола находится горелка со спиртом, закрытая керамическим колпачком.
Перед работой поверхность стола тщательно промывают водой с моющим раствором и обрабатывают кусочком ваты, смоченной в спирте. Такая подготовка к работе необходима потому, что даже осевшая на поверхность стола пыль является потенциальным источником заражения культуры.
При работе все операции следует проводить в непосредственной близости от зажженной горелки, чтобы обеспечить максимальную защиту растворов от заражения. Кисти рук должны находиться между горелкой и задней стенкой ламинара
Инвертированный микроскоп
(источник
света находится сверху).
Он
позволяет рассматривать объект снизу,
что очень удобно, так как клетки
прикрепляются ко дну культуральной
посуды.
|
|
Другой
световой микроскоп несет на себе
фотонасадку (показана стрелкой) для
фотографирования клеток при различных
условиях освещения.
Основные принципы стерильной работы с культурами клеток. Клеточные технологии базируются на двух основных принципах. Главное требование – соблюдение строгой асептики. Все работы по получению культур растительных и животных клеток, их пересадкам производятся в ламинар-боксах. Второе условие – использование специальных питательных сред. Культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Для культивирования растительных и животных клеток требуются многокомпонентные питательные среды. Среды для культивирования растительных клеток включают 20-25 компонентов. Количество компонентов отдельных питательных сред для культивирования животных клеток может достигать 60. Основное условие успешного культивирования – СТЕРИЛЬНОСТЬ. Загрязнение (контаминация) бактериями, грибами, микоплазмами, вирусами приводит к гибели клеточных культур. Стерилизация – полное уничтожение микроорганизмов и их покоящихся форм (например, спор). Существуют разные методы стерилизации:
При работе с культурами растительных и животных клеток стерилизации должны подвергаться:
Стерилизация рабочего помещения. Для работы с культурами клеток необходимо иметь специальные операционные комнаты либо боксы (чистые помещения/боксы). Стены, пол и потолок операционных комнат должны быть покрыты не сорбирующими пыль и моющимися покрытиями. Чистые помещения. Стерилизация операционной комнаты включает ежедневное тщательное удаление загрязнений и пыли со всех поверхностей с помощью мыльного раствора либо 1-3%-го раствора хлорамина; УФ-облучение перед работой в течение 30 минут Рабочий персонал должен владеть техникой работы в асептических условиях. Предотвращение микробной контаминации через человека достигается применением защитной рабочей одежды. Человек, приступающий к работе, должен быть в чистом халате, шапочке и ватно-марлевой повязке. Перед работой в ламинаре необходимо обработать руки ватой, смоченной в спирте. После этой обработки уже не следует выносить руки за пределы ламинара. Если же это случилось, то необходима повторная обработка рук для исключения попадания микроорганизмов в стерильную зону. Ламинар-бокс. Позволяет в любом помещении создать стерильный рабочий объем, необходимый для работы с культурами клеток. Он обеспечивает постоянный обдув места проведения работ (рабочей поверхности) стерильным ламинарным потоком воздуха. Ламинарное движение воздуха – движение, при котором струйки воздуха двигаются параллельно, обтекая препятствие равномерными слоями. Очистка воздуха проводится путем фильтрации на фильтрах грубой и тонкой очистки, встроенных в прибор. К фильтрам тонкой очистки относятся HEPA-фильтры. HEPA означает «высокоэффективное удержание частиц». По мере загрязнения грубый фильтр промывается, тонкий сменяется. Ламинар-боксы имеют встроенные источники освещения, УФ-облучения. В зависимости от устройства ламинар-бокса поток воздуха в рабочей зоне может быть горизонтальным или вертикальным. В ламинар-боксах с горизонтальным потоком воздуха поток очищенного воздуха из рабочей зоны выходит непосредственно в окружающее пространство. Такое оборудование используется при работе с заведомо непатогенным материалом. В ламинар-боксах с вертикальным потоком воздуха воздух перед выходом из рабочей зоны дополнительно фильтруется, возможность обдува оператора при этом исключена. Могут быть использованы для работы с потенциально патогенным материалом. С помощью вентиляторов в приборе обеспечивается рециркуляция воздушного потока, заключающаяся в том, что воздух из рабочего объема попадает на специальный фильтр тонкой очистки, откуда часть его выходит в окружающее пространство (20-35%), а остальной (65-80%) поток повторно проходит через НЕРА-фильтр и вновь поступает в рабочий объем. Возможность попадания выходящего воздуха на оператора предотвращается созданием зоны подсоса на открытой стороне рабочего объема бокса. Передняя часть рабочего объема закрыта прозрачным стеклом, перемещаемым по высоте. Бокс оснащен индикатором загрязнения фильтра тонкой очистки. Преимущества ламинарных шкафов с вертикальным потоком воздуха заключаются в отсутствии постоянного обдува оператора и блокирования потока воздуха, вызванного крупными объектами. При работе в ламинар-боксе с вертикальным потоком воздуха категорически запрещается проносить руки работающего персонала, нестерильные предметы над открытой поверхностью стерильных культуральных сосудов. Классы биологической безопасности ламинар-боксов: 1. Боксы биологической безопасности класс I (защита оператора и окружающей среды). Обеспечивает удаление контаминации, создаваемой в боксе, с помощью входящего воздушного потока через окно оператора с последующей эффективной его фильтрацией. Нет защиты продукта от внешних загрязнений 2. Боксы биологической безопасности класс II (защита продукта, оператора и окружающей среды). Чаще всего применяются при работе с культурами растительных и животных клеток и тканей. 3. Боксы биологической безопасности класс III (ультра-защита продукта, оператора, окружающей среды). Применяются при работе с особо опасным микробиологическим материалом, вирусами, бактериями; при работе с радиоизотопами, канцерогенами; при сборке электронных компонентов, а также в фармацевтике, криминалистике, органическом синтезе. Стерилизация посуды. Успех культивирования клеток во многом зависит от строгого соблюдения правил проведения подготовительных работ по мойке, стерилизации лабораторной посуды и инструментов. Для культивирования растительных и животных клеток используют стеклянную либо пластиковую посуду. Пластиковая посуда одноразового использования поступает в стерильном виде. Стеклянная культуральная посуда используется многократно, перед употреблением должна быть тщательно вымыта и затем простерилизована. Для мытья посуды следует использовать нетоксичные детергенты. В растворе детергентов посуда выдерживается несколько часов, затем тщательно промывается проточной водой, а затем дистиллированной водой (споласкивается несколько раз) Способы стерилизации посуды:
Перед стерилизацией все отверстия в стеклянной посуде (горлышки бутылей, флаконов) заворачиваются в двойной слой фольги Стерилизация инструментов. Включает два этапа:
(сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 2 ч при 140°С; кипячением);
(в ламинар-боксе инструменты стерилизуют еще раз, помещая в фарфоровый стакан с 96%-ным этиловым спиртом и обжигая в пламени спиртовки). Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции! Стерилизации питательных сред. Достигается с помощью следующих способов: термическая стерилизация и фильтрующая стерилизация.
Главное преимущество термической стерилизации по сравнению с другими способами – надежность; один главный недостаток – разрушение термолабильных компонентов питательной среды. Питательные среды, не содержащие термолабильных веществ, стерилизуют автоклавированием при давлении 0,5–1 атм. Продолжительность стерилизации зависит от объема среды в сосуде. Культуральные сосуды со средой объемом 25–50 мл стерилизуют в течение 15–20 мин, объемом 2–4 л – в течение 30–40 мин. Другим способом стерилизации может быть дробная стерилизации – тиндализация, которую проводят при температуре 100 С и атмосферном давлении. Среду кипятят в течение 10 мин, затем охлаждают ее и повторяют эту процедуру дважды с промежутком в одни сутки. Для стерилизации растворов с термолабильными соединениями (растительные экстракты, белки, аминокислоты, витамины, антибиотики, некоторые стимуляторы роста), которые разрушаются при автоклавировании, применяют метод фильтрующей стерилизации. Контроль стерильности и контаминации клеточных культур. Если культура растительных клеток загрязнена быстрорастущими микроорганизмами, то такое заражение легко обнаруживается уже на 2-3 сутки после посадки. Заражение культуры проявляется в виде ореола из бактериальной или грибной инфекции на поверхности агара вокруг каллуса. Если инфицирована питательная среда, то колонии микроорганизмов распределяются в толще агарового слоя. Суспензионная культура растительных клеток приобретает вид разбавленного молока. Признаки контаминации культур животных клеток:
Проверку материала на контаминирование вирусами проводят в вирусологических лабораториях с помощью специальных методов. Заражение культуры микоплазмой не выявляется невооруженным глазом, не приводит к изменению роста культуры, однако существенно изменяет биохимию клеток. Следует один раз каждые 1-3 мес проверять культуры на наличие в них микоплазмы. |
|
2. Принципы разработки сред для культивирования клеток. Бессывороточные среды и среды определенного химического состава.
После извлечения клеток из ткани или организма и помещения их в культуру культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Это обеспечивает выживание клеток, их пролиферацию и дифференцировку. Внеклеточная среда должна обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, т.е. обладать всем необходимым для роста и выживания клеток. Культуры клеток животных и человека предъявляют определенные требования к жидкой (питательная среда), газообразной (концентрация газов) и твердой (поверхность субстрата) фазе. Питательная среда представляет собой раствор определенного состава, к которому добавляются компоненты невыясненного биологического происхождения (добавки плазмы, сыворотки крови, тканевые экстракты и т.д.). Основу питательных сред составляют солевые растворы. Минеральные компоненты в этих растворах подобраны так, что раствор выполняет буферные функции, поддерживая постоянный кислотно-щелочной баланс среды в процессе культивирования. Постоянство рН среды является одним из главных требований условий культивирования.
Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса.
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) (Осмоляльность, мосмоль/кг — 271-300) – мало бикарбоната!
Буфер Эрла (Earle’s Balanced Salts) (осмоляльность 310.6 мосмоль/кг, реальная 283) –
много бикарбоната!
PBS или DPBS - буфер фосфатный модифицированный Дульбекко pH 7,4
NaCl 137mM, KCl 2,7mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 1,76mM
с/без кальция и магния
Другим важным условием культивирования является осмотическое давлении. Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Для поддержания рН в большинстве сред используется бикарбонатный буфер: HCO3 = CO2 + OH, если выделяется углекислый газ, увеличивается концентрация ОН. Растворы могут содержать малое количество бикарбонатного буфера (раствор Хенкса), они предназначены для поддержания рН в плотно закрытых сосудах. В других (растворе Эрла) бикарбоната больше, они используются в системах с повышенным парциальным давлением СО2. Если культуры ведутся вне СО2 инкубатора, где рН поддерживать труднее, необходимы альтернативные буферные системы. Хорошим буфером является HEPES 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновая кислота
Основные компоненты культуральной среды:
1) Компоненты, обеспечивающие буферную систему культуральной среды (рН для большинства клеток 7,2-7,4). Бикарбонат натрия поддерживает «естественную» буферную систему культуральной среды (CO32- /HCO3-); требуя содержания 5-10 % СО2 в атмосфере, что легко выполнимо при культивировании клеток в СО2-инкубаторе. ХЕПЕС представляет собой фосфатную соль с буферной емкостью в пределах 7,2-7,4 рН. Не требует контролируемой газовой среды, в больших концентрациях может быть токсичен . Феноловый красный используется как индикатор рН (Для культивирования клеток, чувствительных к эстрогену рекомендуется использовать среду без фенола красного) Неорганические соли поддерживают осмотическое давление в среде и помогают в регуляции мембранного потенциала, обеспечивая среду ионами натрия, калия и кальция. Оптимальное значение осмоляльности лежит в пределах 260-340 мосмоль/кг в зависимости от типа культивируемых клеток.
2) Аминокислоты L-глутамин; обеспечивает азотом НАД, НАДФН и нуклеотиды, являясь вторичным источником энергии для метаболизма клетки. Заменимые аминокислоты.
3) Углеводы глюкоза, галактоза
4) Белки и пептиды альбумин, трансферрин и фибронектин; альфа2 макроглобулин, особенно важны при бессывороточном культивировании!
5) Жиры и жирные кислоты особенно важны при бессывороточном культивировании!
6) Витамины рибофлавин, тиамин и биотин.
7)Добавки сыворотка; 5-10 %. (альбумины, факторы роста и ингибиторы роста, цитокины, гормоны; является источником витаминов, аминокислот, белков, углеводородов, жиров, микроэлементов, факторов роста).
8)Антибиотики добавляются для предотвращения контаминации культуральной среды бактериями и грибами; однако антибиотики не предотвращают заражение культуральной среды микоплазмой!
Среды:
Среда MEM (Minimum Essential Medium), среда Игла - содержит 13 аминокислот, 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата среды МЕМ с солями Эрла и Хэнкса, а также α-модификация среды MEM с содержанием всех 21 аминокислот и солями Эрла. МЕМ используется только с сывороткой, так как в ней отсутствуют биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы.
Среда BME (Basal Medium Eagle)
Среда DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) содержит в четыре раза больше аминокислот и витаминов, чем BME, а также различные добавки, улучшающие рост клеток. Есть модификации среды DMEM (с высоким и пониженным содержанием глюкозы, пирувата натрия, различных добавок) для культивирования клеток различных типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридом. необходим инкубатор с 10% концентрацией СО2.
Среда DMEM/F-12 в соотношении 1:1 применяется для выращивания широкого спектра клеточных культур. Очень богата питательными веществами.
Среда RPMI-1640 была разработана в Roswell Park Memorial Institute (изначально - культивирования лейкоцитов).
Среда IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) - это модификация среды DMEM, содержащая селенит натрия, добавочные аминокислоты и витамины, пируват натрия, ХЕПЕС и нитрат калия вместо нитрата железа. Среда IMDM используется для поддержания культуры клеток В лимфоцитов, В клеток, стимулированных полисахаридами, Т лимфоцитов и гибридом.
Среда 199 - Используется без добавок, как поддерживающая для первичных клеток, а с сывороткой как ростовая среда для быстро размножающихся клеток. Нормальные, сохраняющие специфические функции клетки на стандартных средах не размножаются (если не трансформированы). Для оптимального роста клеток обычно добавляют 5 - 20% фетальной (эмбриональной) сыворотки.
Среды F-12 и F-10 изначально были разработаны Хэмом (Ham′s nutrient mixture) для культивирования СНО клеток, HeLa и мышиных L-клеток. Обе среды были разработаны для бессывороточного культивирования. Среда F-12 применяется для культивирования широкого спектра клеток млекопитающих и гибридом.
Среда Шнейдера (Schneider’s Insect Media) клетки дрозофилы
Среда Лейбовица
В зависимости от необходимости добавления сыворотки выделяют несколько типов сред:
Основные (базовые) среды (basal media) (требуют добавления 10% сыворотки)
Улучшенные среды (advanced media) (требуют добавления 1-5% сыворотки)
Бессывороточная среда (serum-free medium) (не требуют добавления сыворотки)
Виды сыворотки: 1) эмбриональная бычья сыворотка (Fetal bovine serum, FBS)
2) Сыворотка молодых бычков (BS)
3) Сыворотка новорожденных телят, стерильно отфильтрованная
Базовые клеточные среды: MEM, DMEM, DMEM/F-12 и RPMI 1640
Улучшенные среды: Advanced - MEM, -DMEM, -DMEM/F-12 и - RPMI 1640. Содержат дополнительные питательные вещества и вещества из сыворотки животных: этаноламин, глутатион, аскорбиновую кислоту, инсулин, трансферрин, богатый липидами бычий сывороточный альбумин (AlbuMAX® I), микроэлементы: селенит натрия, метаванадат аммония, сульфат меди и хлорид марганца.
Бессывороточные среды: как правило, разрабатываются для конкретных клеточных линий с учетом их особенностей и потребности в определенных факторах роста - Среды F-12 и F-10
Специальные среды:
- для разработки гибридом:
HT – смесь гипоксантина и тимидина, необходимых для синтеза аминокислот по запасному пути. Используется для культивирования гибридом.
HAT – смесь аминоптерина, гипоксантина и тимидина. Используется для отбора гибридных клеток.