25. Доказательства полуконсервативной схемы репликации днк.

Уотсон и Крик предложили гипотезу репликации ДНК посредством разделения нитей, которая заключалась в том, что две цепи вначале разделяются, а затем каждая из них строит комплементарную себе.

Эта гипотеза получила подтверждение в опытах Мезельсона М. и Сталь Д. (1958). Они работали с бактерией Ercherichia coli. Пурины и пиримидины содержат азот, поэтому для выращивания бактерий использовали среду, содержащую тяжелый азот. Через 12 поколений тяжелый азот включался в состав ДНК. Затем бактерии переносили на среду, содержащий легкий азот. Было доказано, что после первого(!) клеточного деления на среде с легким азотом, плотность ДНК была промежуточной между легкой и тяжелой, т.к каждая цепь состоящая прежде из тяжелого азота присоединяла к себе комплементарную цепь легкого азота. Соответственно ½ цепей ДНК представляла легкие молекулы, ½ тяжелые.

Такой способ репликации получил название полуконсервативной, т.к каждая из двух материнских цепей ДНК пристраивает комплементарные дочерние. В результате каждая из вновь образовавшихся молекул ДНК состоит из одной материнской цепи и одной вновь синтезированной.

26. Полимеразная цепная реакция. Схема. Возможности применения.

ПЦР – многократное умножение последовательности нуклеотидов за счет амплификации (увеличения) праймеров (затравка для синтеза комплементарной цепи в репликации ДНК). Способ многократного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК.

Схема:

1. Денатурация, разрушение водородных связей. На первом этапе исследуемая двухнитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму, при температуре 95 °С.

2. Отжиг праймеров (присоединение праймеров к комплементарным участкам, создавая затравки) ДНК–полимеразой III. Снижение температуры до 62 °С.

3. Элонгация - синтез комплементарной ДНК с помощью ДНК–полимеразы. Оптимальная температура для работы фермента – 72 °С.

4. Денатурация образовавшихся двухнитевых структур или остановка синтеза заморозкой.

ПЦР проводится автоматически в амплификаторе. Повторяющиеся циклы денатурации, отжига праймеров и элонгации приводят к быстрой амплификации специфического участка ДНК.

После примерно 35 таких циклов можно разделить молекулы в среде на электрофорезе за счет разности зарядов.

Возможности применения: Вследствие большой эффективности и широты применения, ПЦР является важнейшим инструментом для любых исследований в молекулярной биологии: прямое определение наличия возбудителей инфекционных заболеваний путем выявления чужеродного ДНК, возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.)

27. Репарация днк. Основные типы репарации. Ферменты, обеспечивающие репарационные события.

Репарация – процесс исправления ошибок последовательности ДНК, возникших в результате какого–либо воздействия или репликации (процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК).

Системы исправления:

1. введение одноцепочечных разрывов,

2. удаление основания, в результате чего его гомолог остается неспаренным

3. превращение одного основания в другое, которое неправильно спарено с основанием партнером

4. введение ковалентных связей между основаниями на одной цепи ДНК или между основаниями на противоположных цепях.

Наиболее распространенными являются эксцизионная и рекомбинационная репарации:

1. Системы эксцизионной репарации удаляют из ДНК химически поврежденные основания и синтезирут ее новую последовательность.

2. Системы рекомбинационной репарации восстанавливают нормальную цепь ДНК, замещая брешь, оставленную во вновь синтезированной цепи напротив сайта нерепарируемого повреждения.

Ферменты:

Участок вокруг поврежденного или неспаренного основания вырезается эндонуклеазами.

Пробел заполняется в направлении от 5’ к 3’ в результате репаративного синтеза ДНК с участием бета–полимеразы.

Матрицей служит противоположная цепь.

Восстановление же непрерывности цепи ДНК осуществляется ДНК–лигазой.