Методы изучения вирулентных фагов

Для выделения фага из объектов внешней среды, органов и выделе­ний человека и животных, культур микроорганизмов и т.д., материал из которого получают фаг, обычно фильтруют с помощью бактериальных фильтров.

Подготовка материала:

1. Жидкий материал (кровь, мочу, воду, смывы с предметов и т. п.) освобожда­ют от крупных частиц с помощью бумажного фильтра или центрифуги­рованием, чтобы они не забили поры бактериального фильтра.

2. Вязкий материал (гной, кал) эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне, после чего освобождают от крупных частиц, как описано выше.

3. Плотный материал (кусочки органов, пищи и т.п.) предварительно измельчают, растирают в ступке со стерильным кварцевым песком, стерильными кончиками пасте­ровских пипеток или битыми покровными стеклами. Подготовленный материал тщательно эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида или бульоне и освобождают от крупной взвеси.

Полученный материал пропускают через бактери­альный фильтр, освобождая от посторонней микрофлоры.

Подготовка культур микроорганизмов (известных или изучаемых).

В работе с фагом применяют 20 - 24 часовые агаровые культуры, или 2 - 6 часовые бульонные культуры. Для определения чистоты культуры готовят маз­ки, окрашивают их фуксином Пфейффера или по Граму. В пробирку со скошенным агаром содержащим выращенную культуру наливают 3 - 5 мл изото­нического раствора натрия хлорида и готовят взвесь микроорганизмов, вращая пробирку между ладонями, осторожно смывая культуру с поверхности среды так, чтобы не намочить пробку. Взвесь переносят в стерильную пробирку и разводят 1:10 (0,5 мл взвеси в 4,5 мл изотониче­ского раствора натрия хлорида).

Вся работа с фагом требует соблюдения асептики. Для этого необходима стерильная посуда (градуированные и пастеровские пипетки, чашки Петри, пробирки, воронки, колбы, ступки), а также термостат, бактериальные фильтры, центрифуга, штативы и прибор для счета колоний.

Качественные методы определения бактериофагов.

Вирулентные бактериофаги лизируют чувствительные к ним микробные культуры (тест-культура).

Выявление фага на плотных средах. Приготовленную взвесь тест-культуры засевают «газоном» в чашку Петри на поверхность агара. Посев подсушивают в термостате 30 - 40 мин при открытой крышке, затем наносят на чашку каплю изучаемого материала. Когда жидкость впитается, чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С на 18 - 20 часов. При наличии фага в изучаемом материале, произойдет лизис тест - культуры и на месте, куда была нанесена капля, культура или совсем не вырастет (сплош­ной лизис) или образуются отдельные колонии фага.

Выявление фага в жидких средах. Для опыта используют две пробирки с мясо-пептонным бульоном, в которые вносят по одной капле культуры микроба, в отношении которого изучают фаг. В первую пробирку добавляют исследуемый фаг или фильтрат материала, в котором его определяют, а вторая пробирка служит контролем роста культуры. Посевы термостатируют 12 - 20 часов при 37 °С. Результаты учитывают только при наличии роста культуры в контроле (помутне­ние среды). Отсутствие видимого роста или последующее просветление среды в пробирке с изучаемым матери­алом подтверждает присутствии фага. Если в этой пробирке отмечается помутнение, то исследование необходимо дополнить посевом на плотную среду, так как помутнение могло произойти из-за роста культуры устойчивой к фагу. Если в посеве на МПА фаг не будет обнаружен, то можно сделать вывод, что его нет в изучаемом мате­риале.

Количественные методы.

При проведении многих микробиологических исследований количественные методы определения фагов имеют большое значение. Врачу нужно знать активность фага, чтобы правильно установить его дозу для лечения и профилактически инфекционного заболевания, а исследователю - чтобы выяснить, как изменяет­ся активность фага в эксперименте.

Активность фага выражают понятием титр. Его можно определять на жидких питательных средах по методу Аппельмана и плотных питательных средах титрованием по методу Грациа.

Титр фага в жидкой питательной среде — наибольшее его разведение (или наименьшее количество), которое подавляет рост тест - культуры в условиях данного опыта, а на плотной среде титр фага — количество фаговых частиц (вирионов) в 1мл ис­ходного материала.

Титрование фага в жидкой среде по методу Аппельмана. В 12 стандартных стерильных пробирок наливают по 4,5 мл стерильного бульона. Уровень жидко­сти во всех пробирках должен быть одинаковым, для чего бульон разливают пипет­ками, объемом 5 или 10 мл. При постановке опыта нельзя использовать нестандартные пробирки, различающиеся между собой диаметром и высотой.

Пробирки ставят в штатив и нумеруют от 1 до 10. При титровании фага ставят контроль культуры (КК) — т.е. на ее способ­ность выживать и размножаться на данной среде и контроль фага (КФ) и бульона на стерильность. На одиннадцатой пробирке пишут «КК» (контроль культуры), а на двенадцатой - «КФ» (контроль фага). Все про­бирки, в которых проводят опыт, должны быть надпи­саны.

В десяти пробирках готовят последовательные деся­тикратные разведения фага с 10^1 до 10^10 (см. таблицу 1). Для разведения фага пользуются пипетками, объемом 1-2 мл. В первую пробирку и контроль фага вносят по 0,5 мл фага. Сменив пипетку, новой пипеткой тщательно перемешивают содержимое 1-й про­бирки и переносят 0,5 мл его во 2-ю пробирку; 0,5 мл содержимого 2-й пробирки переносят в 3-ю и так далее до 10-й пробирки, меняя каждый раз пипетки. Перемешав содержимое 10-й пробирки, 0,5 мл жидкости из нее выли­вают в дезинфицирующий раствор. Также поступают с содержимым пробирки контроля фага. Уровень жидкости в пробирках должен быть одинаковым.

Во все пробирки, кроме пробирки контроля фага, вносят по 1 капле (0,05 мл) взвеси тест - культуры. Пробирки встряхивают. Во всех пробирках, кроме пробир­ки контроля фага, должна появиться слегка заметная муть. Если этого не происходит, все операции с не стан­дартной пробиркой повторяют вновь.

Пробирки с посевами помещают в термостат при 37 °С на 18-20 часов, затем учитывают результат титрования.

Учет результатов обязательно следует начинать с контролей. При правильной постановке опыта содержимое пробирки КК становится мутным, что указывает на рост и размножение бактерий и что питательная среда обеспечивает развитие микроорганизмов в данных условиях опыта. Соответственно, отсутствие помутнения в пробирках с культурами, в которые был внесен фаг, указывает на его литическое действие. В пробирке с контролем фага (КФ) жидкость должна остать­ся прозрачной. Это позволит сделать вывод, что посуда, бульон и фаг стерильны, т.е. не загрязнены посторонней микрофлорой.

После учета правильных результатов контролей регистриру­ют характер изменений в десяти опытных пробирках. Рост культуры в пробирках «опытного» ряда говорит об отсут­ствии или недостаточном количестве в них фага в материале от больного. Затем устанав­ливают титр фага, то есть его наибольшее разведение, в котором произошел лизис культуры и содержимое пробир­ки прозрачно. Обозначают титр степенью разведения фага со знаком плюс, что соответствует порядковому номеру пробирки. Например, если культура не растет в пяти опытных пробирках, титр фага равен 10⁵ (таблица 1).

Таблица 1 - Схема титрования фагов по методу Аппельмана

Ингредиенты	Пробирки
	Опыт										контроль
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	куль-ры	фага
Бульон	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5
Исследуемый фаг	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5		0,5
Культура микроба	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	
	Разведение фага
	101	102	103	104	105	106	107	108	109	1010		101
Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37С 18-10 ч.
Результат	–	–	–	–	–	-	+	+	+	+	+	–

• отсутствие роста микробов в пробирке;

+ наличие роста микробов.

Титрование фага на плотной среде методом агаровых слоев по Грация. Метод позволяет определить количество фаговых частиц в титруемом материале. Основан на том, что каждая частица фага на чашке Петри с чувствительными бактериями, засеянными газоном, дает зону просветления (лизиса), то есть образует отдельную негативную колонию, или бляшку.

Чашки с 20-25 мл МПА покрывают сте­рильной фильтровальной бумагой и подсушивают в термостате или под бактерицидной лампой (расстояние от лампы не более 2 м). Титруемый фаг разводят от 10^-1 до 10 ^-10 (как в предыдущем опыте). Полученный материал из каждого разведения переносят по 1 мл в другие пронумерованные пробирки, в которые заранее наливают по 2,5 мл 0,7% МПА, расплавленного и остуженного до 45 °С (соответственно из 1-й в 1-ю и так далее до 10-й). После этого в каждую пробирку добавляют по 0,1 мл тест-культуры. Содержимое пробирок быстро перемешивают, не давая застыть агару и выливают на поверх­ность среды в чашке Петри с номерами, соответствующими номерам пробирок. После застывания агара чашки ставят в термостат при 37 °С.

Результаты опыта учитывают через 18-20 часов. В отрицательном случае зоны лизиса бактерий на чашках с посевами будут отсутствовать. В положительном случае при большой концентрации фага (в первых чашках) произойдет сплошной лизис культуры. В тех разведениях фага, в которых находилось небольшое количество частиц фага, появятся изолированные колонии, которые необходимо подсчитать. Для исключения ошибки в подсчете, каждую учтенную колонию помечают со стороны дна чашки. Чтобы установить количество частиц фага в 1 мл фаголизата, пользуются формулой:

п = у х 10 ^х, где п - искомое число; у - количество выросших на чашке колоний фага; х - степень разведение фага в чашке, в которой подсчитаны колонии.

Например, если в чашке с разведением фага 10^-3 (1:10³) выросло 15 колоний, то в 1 мл исходной жидкости содержится 15 х 10³ или 1,5 х 10⁴ частиц фага.

Более точные результаты получают, если определяют количество частиц фага в исходной жидкости по нескольким разведениям и вычисляют среднее арифметическое. Например, при разведении фага 10^-4 выросло 320 колоний, следовательно, в 1 мл исходной жидкости было 320 x 10⁴ или 3,2 х 10⁶/мл частиц фага. При разведении фага 10^-5 выросло 31 колонии, следовательно, в исходной жидкости было 3,1х10⁶/мл частиц фага. При разведении фага 10^-6 выросло 3 колоний, следовательно, в исходной жидкости было 3х10⁶/мл частиц фага. Сложив величины, полученные при этих подсчетах и разделив сумму на 3 (количество проведенных подсчетов), устанавливают число частиц фага в 1 мл титруемого препарата. В нашем случаен оно равно 3,1 х 10⁶/мл частиц фага.

Подсчитывать колонии лучше всего на чашках, где выросло не меньше 5 и не больше 50 колоний. В противном случае страдает точность подсчета. Если на чашке много колоний, чашку можно разделить на несколько секторов, сосчитать колонии на одном из них и полученную цифру умножить на количество секторов.