ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙУНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГОРАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ

БАКТЕРИОФАГИ

Учебно-методическое пособие для студентов

медицинских вузов

Казань, 2012

ББК 52.669.3

УДК 578.81

Печатается по решению Центрального координационно-методического совета Казанского государственного медицинского университета

Составители:

профессор, доктор медицинских наук Поздеев Оскар Кимович,

доцент, кандидат медицинских наук Федорова Елена Романовна,

ассистент, кандидат медицинских наук Валеева Юлия Владимировна.

Рецензенты:

проректор по научной работе и инновациям, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ, доктор медицинских наук, профессор П.В.Калуцкий, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ, доктор медицинских наук, профессор А.М. Королюк.

Бактериофаги (строение, свойства, практическом применение). Учебно-методическое пособие для студентов/ Поздеев О.К., Федорова Е.Р., Валеева Ю. В. - Казань: КГМУ, 2012. – 50с.

Предназначено для самостоятельной работы студентов всех факультетов. Учебно-методическое пособие содержит сведения о строении, свойствах бактериофагов и их практическом применении, вопросы для самоконтроля, тесты задания и задачи по теме: «Бактериофаги».

Казанский государственный медицинский университет, 2012 Оглавление

Введение……………………………………………………………....................4

История открытия и изучения бактериофагов………………..…..………..……4

Химический состав фагов……………………………………….………............7

Антигенные свойства фагов………………………………………………..........7

Морфология бактериофагов…………………………………………...…..........8

Репродукция бактериофагов………………………………………………..........8

Феномен лизогении………………………………………………………….….…8

Лизогенная конверсия………………………………………………………..….14

Оценка действия литических бактериофагов……………………………........18

Методы изучения вирулентных фагов…………………………………..….….19

Методы выделения фагов…………………………………………………….....24

Практическое применение фагов………………………………………….…....24

Лечебно – профилактическое применение бактериофагов……………….…...30

Коммерческие препараты бактериофагов………………………………...…….33

Практическое занятие………………………………………………………..…..41

Вопросы для самоподготовки…………………………………………….….….42

Тестовые задания……………………………………………………………..….43

Ситуационные задачи………………………………………………….….……..44

Эталоны ответов…………………………………………………….…………...45

Оснащения занятия………………………………………………………….…..46

Литература…………………………………………………………………..……48

Приложение………………………………………………………………..……..49

Бактериофаги [от «бактерия», + греч. phagein, поедать] - группа вирусов, паразитирующих в бактериальных клетках. Чаще репродукция дочерних популяций бактериофагов внутри бактерий вызывают их разрушение. Бактериофаги, или фаги, широко распространены в природе — их выделяют из воды, почвы, организмов различных животных и человека. В настоящее время известны фаги, лизирующие клетки микроорганизмов, принадлежащих ко всем систематическим группам, как патогенным для человека, животных и растений, так и сапрофитам, а также для актиномицетов (актинофаги) и сине-зелёных водорослей. Сравнительно недавно обнаружены фаги, активные против грибков родов Penicillium, Aspergillus и др.

В природных условиях фаги встречаются в тех местах, где есть чувствительные к ним бактерии. Чем богаче тот или иной субстрат (почва, вода, выделения человека и животных и т.д.) микроорганизмами, тем в большем количестве в нем встречаются соответствующие фаги. Так, фаги, лизирующие клетки всех видов почвенных микроорганизмов, находятся в почвах. Особенно богаты фагами черноземы и почвы, в которые вносились органические удобрения. Фаги, активные против разных видов кишечной, дизентерийной, тифозной и паратифозной палочек, часто встречаются в содержимом кишечника человека и животных, сточных водах и загрязненных водоемах. Фаги фитопатогенных микроорганизмов успешнее всего выделяются из остатков растений, пораженных этими микробами. Принципы классификации бактериофагов аналогичны подходам к систематике вирусов вообще. В основу классификации положены тип нуклеиновой кислоты, морфология фагов, спектр действия, антигенная структура, химический состав и др. Большинство фагов относится к ДНК-вым вирусам, с нуклеокапсидом, организованным по принципу смешанной симметрии. По спектру действия выделяют типовые фаги (Т-фаги), лизирующие бактерии отдельных типов внутри вида, моновалентные фаги, лизирующие бактерии одного вида, и поливалентные фаги, лизирующие бактерии нескольких видов.

История открытия и изучения бактериофагов. В 1896 году Эрнест Хэнкин установил наличие выраженной антибактериальной активности воды из Ганга и Джамны в отношении холерного вибриона. Эти свойства сохранялись после пропускания через бактериальные фильтры, но исчезали при кипячении. Хэнкин предположил, что подобные свойства воды из этих рек ограничивают распространения эпидемий холеры, но не смог объяснить этот феномен. Впервые перевиваемый лизис бактерий (сибиреязвенной палочки) наблюдал Н.Ф. Гамалея (1898). При изучении свойств фильтратов сибиреязвенных бацилл, он установил его способность лизировать свежие культуры этих бактерий. В 1915 году Фредерик Туорт наблюдал аналогичные дегенеративные изменения колоний золотистого стафилококка, получившее название «стеклистое перерождение колоний». Под действием некоего фактора белые или желтые, непрозрачные колонии бактерий становились прозрачными и исчезали. Исследователи установили способность фильтратов переродившихся колоний заражать и убивать новые колонии бактерий. Это явление получило название «феномена Туорта», но его природа оставалась неизученной. Истинным открывателем бактериофагов стал Феликс д'Эрель, выделивший от больных дизентерией «анти-шигеллезный микроорганизм» (1915). Именно Ф. д'Эрель, канадский сотрудник Института Пастера в Париже, ввел в практику термин «бактериофаги» - используя суффикс «фаг» не в прямом смысле «поглощать, поедать», а в смысле развития за счет чего-то. Он исследовал действие фильтратов испражнений больных дизентерией на шигеллы. После культивирования в термостате культура бактерий обычно вырастала, но однажды она не выросла, а растворилась, что совпало, по времени, с началом выздоровления больного. Это позволило Ф. д'Эрелю сделать вывод, что бактерии растворяет некий живой агент, проходя­щий через бактериальные фильтры, то есть вирус. Путем многочисленных пассажей на культурах шигелл в качестве «клеток-хозяев», Ф. д'Эрель размножил популяцию бактериофагов и установил их способность образовывать зоны лизиса культурах шигелл, засеянных «газоном» на чашках Петри.

Лишь после создания электронного микроскопа была доказана вирусная природа бактериофагов и изучена их морфо­логия. Открытие Ф. д'Эреля привлекло внимание врачей и позволило использовать фаги для лечения и профилактики ряда инфекцион­ных болезней. В 1934-1935 гг. д'Эрель работал в Тифлисе (Тбилиси, Грузия), помогая в организации Международного Института Бактериофагов.

С самого начала, одним из главных направлений практического применения фагов было фаготипирование - идентификация бактерий путем определения спектра их чувствительности к специфическому набору фагов. Высокая эффективность метода обусловлена высокой специфичностью многих бактериофагов в отношении их хозяев и его широко используют во всем мире.

Не менее широко в лечении самых разнообразных инфекций использовалась фаготерапия. Фаги наносили непосредственно на место поражения, вносили внутрь, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно либо применяли в виде аэрозолей или клизм. Их даже вводили внутрь легких, в сонную артерию и перикард. В 40-х годах ХХ века началась эпоха антибиотикотерапии и везде, исключая СССР, разработки новых бактериофагов вычеркнуты из числа перспективных исследований. Однако, уже в 80-е годы ХХ заговорили о снижении эффективности лечения антибиотиками вследствие выработки бактериями лекарственной устойчивости и интерес к фаготерапии возобновился.

В начало 2000-х годов Гленн Моррис - сотрудник Мэрилендского Университета (США) совместно с НИИ бактериофагов, микробиологии и вирусологии в Тбилиси наладил испытания фаговых препаратов для получения лицензии на их применение в США, а в июле 2007 г. бактериофаги были одобрены для использования в США. На протяжении нескольких последних лет исследования свойств бактериофагов проводят в России, Грузии, Польше, Франции, Германии, Финляндии, Канаде, США, Великобритании, Мексике, Израиле, Индии, Австралии и т.д.

В 1940–1950 гг. работы, проведенные Г.Дельбрюком, С.Луриа, А.Дерманомм, Р.Херши и А.Львоффом по изучению структуры и физиологии взаимодействий «хозяин-фаг», заложили основание для развития молекулярной биологии, которая, в свою очередь, стала фундаментом для целого ряда новых направлений биотехнологии. В настоящее время фаги широко используют в медицинской практике и при различных биологических исследованиях. В настоящее время изучением и применением бактериофагов занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики, генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи, специалисты по генной инженерии и биотехнологии.

По сравнению с бактериями, бактериофаги более устойчивы к воздействию различных химических и физических факторов. Они устойчивы в пределах рН 5,0-8,0, большинство из них резистентны к действию холодных водных растворов глицерина и этанола, а также цианидов, фторидов, динитрофенола, хлороформа, тимола и фенола. Бактериофаги хорошо сохраняются в лиофилизированном состоянии, но разрушаются при кипячении, под действием УФ облучения, кислот, химических дезинфектантов и формалина. Они хорошо сохраняются при низких температурах (до - 200 ^оС в глицерине), но быстро инактивируются при 65-70  С.

Вследствие отсутствия чувствительности к антибиотикам, тимолу, хлороформу и ряду других веществ, уничтожающих сопутствующую микрофлору, эти вещества используют при выделении и сохранении фагов.

Химический состав фагов. Основными компонентами фагов являются белки и нуклеиновые кислоты. Важно отметить, что фаги, как и другие вирусы, содержат только один тип нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК и, в зависимости от типа нуклеиновой кислоты, их разделяют на ДНК-овые и РНК-овые. Нуклеиновая кислота находится в головке. Внутри головки фагов обнаружено также небольшое количество белка (около 3%). Содержание белков и нуклеиновых кислот у разных фагов варьирует. У некоторых их содержание почти одинаковое и каждый из компонентов составляет около 50%. У других фагов соотношение между этими основными компонентами может быть различно. Кроме указанных основных компонентов, фаги содержат в небольших количествах углеводы и, некоторые, преимущественно нейтральные жиры.

Антигенные свойства фагов. Все бактериофаги обладают антигенными свойствами, т.е. способны вызывать развитие тех или иных видов иммунного ответа. После введения фагов в организм опытного животного в сыворотке крови можно обнаружить специфические антитела, способные взаимодействовать только с конкретными фагами. Препараты таких сывороток называют антифаговыми. После взаимодействия фага с антителами, содержащимися в антифаговой сыворотке, происходит инактивация фага - он теряет способность инфицировать и вызывать лизис чувствительных к нему микробов. Поскольку действие каждой антифаговой сывороток строго специфично, то их можно успешно применять для идентификации и классификации фагов, а также очистки микробных культур от фагов. С помощью фаговых антисывороток удалось доказать, что белки оболочки фага отличаются от белков чехла отростка, базальной пластинки и ее нитевидных образований, что говорит о сложности строения фаговой частицы.

Морфология бактериофагов. Внешне большинство бактериофагов напоминают сперматозоиды или головастиков, но среди них встречают и другие формы, на основании чего выделяют пять основных типов бактериофагов (рис.1).

Рисунок 1 - Различные морфологические типы бактериофагов

а. Фаги 1 типа; представлены ДНК-овыми нитевидными фагами, лизирующими бактерии, содержащие F-плазмиды.

б. Фаги 2 типа; представлены головкой и рудиментом хвоста. Геном большинства из них образован молекулой РНК и лишь у фага jc-174 — однонитевой ДНК.

в. Фаги 3 типа; имеют короткий хвост: например, Т-фаги 3 и 7.

г. Фаги 4 типа; включают фаги с несокращающимся хвостом и двухнитевой ДНК: например, Т-фаги 1 и 5.

д. Фаги 5 типа; представлены ДНК-выми вирусами с сокращающимся чехлом хвоста, который заканчивается базальной пластиной: например, Т-фаги 2 или 4.

Строение бактериофагов наиболее полно охарактеризовано на основе изучения Т-фагов кишечной палочки (см. рисунок 2).

Головка Т-фагов образована из однотипных субъединиц, организованных по принципу кубической симметрии, и может достигать размеров 100 нм. Капсомеры головки состоят из белковых молекул, построенных преимущественно из аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также лизина. Содержание белка и ДНК в головке примерно одинаково. Геном большинства фагов образует спирально упакованная двойная нить ДНК. Число фагов, содержащих одноцепочечную молекулу ДНК или РНК, незначительно. У некоторых фагов (например, Т2) в головке находится внутреннийбелок, содержащий полиамины (спермин и путресцин) и обеспечивающий суперспирализацию большой молекулы ДНК. В таком виде она может упаковываться в сравнительно небольшом объёме. В составе фаговой ДНК обнаружены необычные азотистые основания (например, оксиметилцитозин).

Рисунок 2 - Фаг Т4 кишечной палочки до контакта с бактерией (А) и в момент введения фаговой ДНК (Б)

Хвост, или отросток, Т - фагов может достигать 250 нм в длину и 25 нм в ширину. Он включает полый стержень (сконструирован по принципу спиральной симметрии) и сократительный чехол, присоединяющийся к воротничку, окружающему стержень около головки. Чехол образован 120–140 белковыми молекулами, каждая из которых связывает одну молекулу АТФ и ионы Са²⁺. В дистальном отделе стержня расположена шестиугольная базальная пластина с шестью шипами и шестью нитями (фибриллами). У чётных фагов (например, у Т2) окончания фибрилл опущены вниз, а у нечётных - загнуты вверх. У некоторых Т-фагов в дистальной части хвоста находится лизоцим (эндолизин).

Репродукция бактериофагов. В большинстве случаев бактерии, инфицированные бактериофагами, погибают, т.к. размножение и выход дочерних популяций из бактерии сопровождается её разрушением (лизисом). Такие вирусы, вызывающие гибель инфицированных бактерий, известны как литические бактериофаги. Взаимодействие бактериофагов с клеткой специфично так как они инфицируют бактерии только определённого вида. Подобно вирусам животных, репродуктивный цикл литических бактериофагов включает адсорбцию свободного фага на клеточных рецепторах, взаимодействие с ДНК клетки - хозяина, образование копий вирусных белков и нуклеиновых кислот, самосборку и выход дочерних популяций. Однако он включает и существенные различия, отличающие бактериофаги, имеющие хвостовой отросток с сокращающимся чехлом, от прочих вирусов, которые будут рассмотрены ниже (см. рисунок 3).

Адсорбция. Прикрепление фага к бактерии происходит при помощи поверхностных структур бактериальной стенки, служащих рецепторами для вирусов. Например, рецепторы для фагов Т3, Т4 и Т7 расположены в липополисахаридном слое, для Т2 и Т6 — в наружной мембране. На бактериях без клеточной оболочки (протопласты, L-формы) бактериофаги не адсорбируются. Некоторые фаги в качестве рецепторов используют F-пили. Помимо рецепторов, адсорбция фага зависит от рН среды, температуры, наличия катионов и некоторых соединений (например, триптофана для Т2-фага). При избытке фага на одной клетке может адсорбироваться до 200–300 вирусных частиц. Адсорбция фага — пусковой момент его жизненного цикла, а специфичность взаимодействия с рецепторами на поверхности бактериальной клетки обусловливает, в том числе, возможность практического использования бактериофагов, например для идентификации, бактерий, а также для фаготерапии и фагопрофилактики.

Рисунок 3 - Литическое взаимодействие фага с бактериальной клеткой

Инъекция фага. После адсорбции происходит ферментативное расщепление клеточной стенки лизоцимом, находящимся в дистальной части отростка. Базальная пластина хвоста лизирует прилегающий фрагмент клеточной стенки, выделяя присутствующий в отростке лизоцим. Одновременно в чехле высвобождаются ионы Са²⁺, активизирующие АТФазу, что вызывает сокращение чехла и вталкивание стержня хвоста через цитоплазматическую мембрану в клетку. Затем вирусная ДНК «впрыскивается» в цитоплазму (внедрение вирусной ДНК). Поскольку диаметр канала лишь немного превышает диаметр молекулы ДНК (около 20 нм), то ДНК способна попадать в цитоплазму только в форме нити. При этом структурные элементы фага - капсид и отросток - остаются вне клетки.

Взаимодействие с геномом бактериальной клетки. Проникнув в клетку, нуклеиновая кислота фага «исчезает», т.е. диссоциирует, и уже через несколько минут обнаружить вирус не удаётся. В этот, так называемый скрытый период (эклипс) вирус берёт на себя генетическое управление клеткой, осуществляя полный цикл репродукции фага. К его окончанию составляющие фага соединяются в зрелый вирион. В зависимости от типа нуклеиновй кислоты, установление фагового генома может реализоваться через взаимодействия:

а) однонитевой ДНК - с репликативным аппаратом для синтеза комплементарной ей нити и образования репликативной формы; далее ее поведение аналогично двунитевой ДНК;

б) двунитевой ДНК - с транскрипционным аппаратом для синтеза мРНК и последующей трансляции вирусспецифичных белков (ферментов и структурных);

в) РНК (через геном бактерии) - к трансляционному аппарату для синтеза вирусспецифичных белков (ферментов репликации и структурных).

Поскольку большинство бактериофагов являются ДНК-овыми вирусами, то после инъекции вирусной ДНК (вДНК) в цитоплазму бактериальной клетки, клеточные РНК-полимеразы транскрибируют ДНК в мРНК, транслирующуюся на рибосомах. В результате осуществляется синтез вирусной полимеразы и других ранних вирусных белков. Вирусная полимераза участвует в образовании вДНК дочерних популяций. Часть образовавшейся в ДНК используется как матрица для синтеза белков головок и хвостов. После присоединения в ДНК последние образуют дочернюю популяцию фагов.

Синтез фаговых белков. В первую очередь синтезируются ферменты, необходимые для образования копий фаговой ДНК. К ним относятся ДНК-полимераза, киназы (для образования нуклеозидтрифосфатов) и тимидилат синтетаза. Они появляются в клетке через 5–7 мин после её заражения. Клеточная РНК-полимераза транскрибирует вирусную ДНК в мРНК, которая транслируется бактериальными рибосомами в «ранние» белки фага, включая вирусную РНК-полимеразу и белки, способные посредством различных механизмов ограничивать экспрессию бактериальных генов. Вирусная РНК-полимераза осуществляет транскрипцию «поздних» белков (например, белков оболочки и эндолизина), необходимых для сборки фаговых частиц дочернего поколения. Некоторые вирусы расщепляют ДНК клетки-хозяина до нуклеотидов, чтобы использовать их для синтеза собственных нуклеиновых кислот.

Репликация нуклеиновых кислот. Реализуется за счёт активности вновь синтезированных вирусных ДНК-полимераз, производящих множественные копии вирусных нуклеиновых кислот.

Выход дочерних популяций. Вновь синтезированные белки формируют в цитоплазме пул предшественников, входящих в состав головок и хвостов дочерних вирусных частиц. Другой пул содержит ДНК потомства. Специальные аффинные области в вирусной ДНК индуцируют объединение предшественников головок вокруг агрегатов нуклеиновой кислоты и образование ДНК-содержащих головок. Заполненная головка затем взаимодействует с хвостовой частью, образуя функциональный фаг. Весь процесс (от адсорбции до появления вновь синтезированных вирусов) занимает около 40 мин. После образования потомства («урожай», или выход фага, составляет 10–200 из одной инфицирующей частицы) клетка хозяина лизируется, высвобождая дочернюю популяцию. В разрушении клеточной стенки участвуют различные факторы: фаговый лизоцим, увеличенное внутриклеточное давление. Вирус, по-видимому, также стимулирует образование аутолизинов либо блокирует механизмы, регулирующие их синтез (подобные литические факторы выявлены в фаголизатах многих бактерий).

Феномен лизогении. При изучении явления бактериофагии исследователи обратили внимание на то, что иногда встречаются культуры микроорганизмов, которые содержат фаги, хотя на эти культуры фагами и не воздействовали. Другими словами, получалось, что вирулентных свойств фага оказывалось недостаточно для разрушения бактерий. Подобные вирусы, известные как умеренные бактериофаги, претерпевают любопытные превращения, известные как редукция фага. Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в «симбиоз», в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. Геном бактериофага, пребывающий в таком состоянии называется профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении, реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса, а также передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков. Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом получило название лизогения, Это название (от греч. lysis, разложение, genea, происхождение) отражает способность профага самопроизвольно либо под действием ряда физических и химических факторов реактивироваться и запускать полный репродуктивный цикл, т.е. вести себя как литический бактериофаг. По своим основным свойствам лизогенные культуры принципиально не отличаются от исходных, но они невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, контролируемые генами профага.

При размножении лизогенной культуры какая-то часть клеток популяции лизируется и освобождает зрелые частицы специфичного для этой популяции умеренного фага. Сохранение способности к инфицированию у умеренного фага зависит от низкомолекулярного белкового репрессора, кодируемого вирусной ДНК и «выключающего» все вирулентные функции бактериофага. Переход умеренного фага на литический цикл развития происходит при нарушениях синтеза белкового репрессора. При этом встроенный в геном бактерии вирус проявляет все свои вирулентные свойства, репродуцируется и лизирует клетки, а также может инфицировать другие бактерии. Образование лизогенными культурами зрелых частиц фага получило название спонтанной индукции. Количество лизируемых клеток и количество образовавшихся зрелых частиц фага зависят от особенностей данной культуры и условий выращивания. В то же время количество клеток, освобождающих фаги, может быть резко увеличено при воздействии на лизогенную культуру некоторыми физическими и химическими факторами, или при создании в среде избытка некоторых питательных веществ и витаминов. При индукции некоторых лизогенных культур удавалось вызывать образование зрелых частиц фага почти у всех клеток. К индуцирующим агентам относятся ультрафиолетовые (УФ), рентгеновские и гамма-излучения, перекиси, азотистый иприт и его гомологи, этиленимин, урацил, многие антибиотики. Наиболее эффективные и широко применяемые индуцирующие факторы - УФ-облучение и антибиотик митомицин С.

Как отмечалось, важным свойством лизогенной культуры является ее устойчивость к содержащемуся в ней фагу. В связи с этим выделение и изучение умеренных фагов лизогенной культуры возможно лишь в том случае, когда имеется другая культура того же вида, которая чувствительна к умеренному фагу, инфицировавшему данную лизогенную культуру. Такие культуры получили название индикаторных. К лизогенным культурам, особенно широко распространенным в природе, сравнительно легко можно подобрать индикаторные культуры среди других разновидностей этого же вида. В отдельных случаях умеренный фаг лизогенной культуры может спонтанно (без внешних воздействий) или под влиянием различных факторов измениться и стать вирулентным. Тогда фаг приобретает способность лизировать все клетки данной культуры. У некоторых лизогенных культур превращение умеренного фага в вирулентный происходит сравнительно легко, но также известны культуры бактерий, у которых экспериментально не удавалось превратить умеренный фаг в вирулентный. Возможность возникновения вирулентных мутантов умеренных фагов имеет большое теоретическое и практическое значение. Не редки случаи, когда единственным доказательством лизогенности культуры является возникновение вирулентных мутантов её умеренного фага. Лизогения широко распространена среди всех систематических групп микроорганизмов.

Лизогенная конверсия. Нередко под влиянием профага происходит изменение свойств микроорганизмов. Такое изменение генетических свойств, вызванное вирусной ДНК, обозначают терминами «инфекционная наследственность» или «лизогенная (фаговая) конверсия». В отличие от истинной трансдукции, где фаг выступает в роли «механического» переносчика генетического материала, при лизогенизации сам фаг (вернее, его нуклеиновая кислота) является тем генетическим материалом, который в виде профага дополнительно придается генетическому материалу клетки. Изменение генотипа и, соответственно, фенотипа в результате фаговой конверсии отмечено у многих бактерий и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и др. Известны бактерии (например, дифтерийная палочка, холерные вибрионы, сальмонеллы, клостридии и др.), вирулентные свойства которых (обычно в виде экзотоксинов или адгезинов) кодируются лизогенными фагами. Иными словами, лизогенная бактерия будет вирулентной, тогда как её нелизогенный «двойник» останется безвредным. Кроме того, лизогения широко распространена среди стрептококков, клубеньковых бактерий, актиномицетов, микобактерий и др., также она выявлена и грибов рода Penicillium и дрожжей. Таким образом, умеренные фаги являются важным фактором изменчивости микроорганизмов.

При лизогении происходит изменение наследственных свойств не только бактериальной клетки, но и фага; размножаясь в клетке, он способен захватывать некоторые гены бактерии и, инфицируя другую клетку, передаёт приобретённые гены новому хозяину. Подобная передача (трансдукция) во многом аналогична генетической рекомбинации у высших растений и животных. Например, -бактериофаг сходен с вставочными последовательностями (IS-элементами) и транспозонами, так как способен включаться практически в любой участок бактериальной хромосомы, привнося свой генетический материал и вызывая мутагенный эффект. При наличии всех типичных свойств фага, -бактериофаг можно рассматривать как гигантский транспозон.

При трансдукции фаг играет роль лишь механического переносчика; при этом лизогенизация клетки не обязательна. Один и тот же фаг может переносить разные свойства. Трансдукция происходит довольно редко: из одного и более миллионов фаговых частиц только одна способна осуществлять трансдукцию. При помощи трансдукции удавалось перенести от клеток-доноров клеткам-реципиентам различные свойства: токсичность, устойчивость к антибиотикам, способность продуцировать определенные ферменты, антигенные и другие свойства.

Есть все основания утверждать, что абсолютное большинство микроорганизмов являются лизогенными. Ни про одну культуру нельзя с уверенностью сказать, что она не лизогенная. К настоящему времени накоплен большой объём данных о том, что многие лизогенные культуры содержат 2, 3, 4 и более умеренных фагов, т.е. являются полилизогенными. Например, многие актиномицеты, проактиномицеты, клубеньковые бактерии и некоторые спороносные бактерии содержат четыре и более фагов. Содержащиеся в полилизогенных культурах фаги часто резко различаются между собой по форме частиц, антигенным свойствам и спектру литического действия. Полилизогенные культуры можно экспериментально получить с помощью воздействия на них одновременно или последовательно различными умеренными фагами. Полученные таким способом культуры не отличаются от бактерий, выделенных из природных источников.

Как уже отмечалось, профаг лизогенной культуры способен превратиться спонтанно или при индукции в зрелую полноценную фаговую частицу. Однако в ряде случаев под влиянием различных факторов у профага возникают стойкие наследуемые изменения (мутации), в результате которых он при индукции не способен превращаться в полноценную частицу. Поэтому у таких культур возникают частицы, состоящие только из головки или только из одного отростка. Возможны и другие нарушения в структуре фаговой частицы. При индукции таких культур лизогенная клетка лизируется, но образовавшиеся частицы как неполноценные не способны к размножению на индикаторной культуре. Наиболее детально изучены дефектные фаги, у которых образуются одни лишь отростки. Такие фаги способны адсорбироваться на клетке, вызвать её лизиз, но не способны к репродукции.

В последние годы такие дефектные фаги привлекают внимание исследователей, так как было установлено, что многие описанные в литературе бактериоцины (вещества, убивающие бактерии) представляют собой дефектные фаговые частицы.

Существуют два принципиально различных типа бактериоцинов. Первые отличает низкий молекулярный вес, отсутствие способности осаждаться при центрифугировании, чувствительность к трипсину, термолабильность. Кроме того, их невозможно обнаружить электронной микроскопией. Бактериоцины второго типа имеют высокий молекулярный вес, осаждаются при центрифугировании, термостабильны и при электронной микроскопии видны в виде фагоподобных частиц или отдельных компонентов фаговой частицы (преимущественно в виде отростков). До настоящего времени, отсутствуют данные, указывающие на происхождение бактериоцинов первого типа и о возможной связи их с лизогенным состоянием культуры - продуцента. В то же время многими исследователями показано, что образование бактериоцинов второго типа тесно связано с дефектной лизогенией продуцента. Наиболее убедительное доказательство дефектной лизогении - выявление дефектных фаговых частиц, количество которых значительно увеличивается при индукции вируса.

Имеются все основания утверждать, что дефектная лизогения также довольно широко распространена. Она выявлена у очень многих культур, например у актиномицета, продуцирующего антибиотик стрептомицин, клубеньковых бактерий, спороносных бактерий, применяемых для борьбы с вредными насекомыми, актиномицетов

Не исключено, что лизогенизация является одним из механизмов защиты бактериальной клетки от фаговой инфекции, выработанным клеткой в процессе эволюции. В известной степени, лизогенизация биологически выгодна и клетке, и фагу. Клетка при лизогенизации становится устойчивой не только к данному фагу, но и к родственным ему фагам и, кроме того, приобретает дополнительные свойства. Фаг же приобретает устойчивость к разнообразным внешним воздействиям и в то же время сохраняет потенциальную возможность перейти в вегетативное состояние и в состояние зрелой инфекционной частицы. Широкое распространение лизогении дает основание рассматривать это явление не как исключительное, а как нормальное на данном этапе эволюции микробов.

Иногда можно встретить так называемые «ложнолизогенные культуры», состоящие из смеси устойчивых и чувствительных к определенному фагу бактериальных клеток. Такие культуры могут быть легко освобождены от содержащихся в них фагов или путем нескольких рассевов, с помощью специфической антифаговой сыворотки, или воздействием веществ, подавляющих активность бактериофагов.

Умеренные фаги широко применяют в генной инженерии, их используют для изучения опухолевого роста, как фактор изменчивости микроорганизмов и в других исследованиях. Так как лизогенные культуры в отличие от «здоровых» чувствительны к радиации, они служат для определения надежности защиты космических кораблей от космических лучей - при ненадежной защите профаг переходит в вирулентную форму и лизирует культуру.

Оценка действия литических бактериофагов. На твёрдых средах в бактериальных культурах, засеянных сплошным «газоном», размножение фагов сопровождается лизисом бактерий и образованием зон просветления — «стерильных пятен». Для их обозначения предложен термин «негативные колонии бактериофага». У разных фагов они имеют строго определённые размеры и форму, например, звёздчатую у дизентерийных фагов (см. рисунок 4). При заражении бульонных культур литическим фагом наблюдают просветление среды. Способность образовывать негативные колонии в культурах чувствительных бактерий широко применяют в качестве метода фагодиагностики при идентификации возбудителей инфекционных болезней.

Рисунок 4 - Рисунок 4. Негативные колонии сальмонеллёзного (А) и дизентерийного (Б) бактериофагов

На чашках Петри, засеянных исследуемыми культурами, бактериофаги образуют негативные колонии, что указывает на род и даже вид бактерии (в зависимости от специфичности фага). При распознавании неизвестных бактериофагов учитывают форму негативных колоний. В данном случае дизентерийный бактериофаг образует характерные звёздчатые колонии.