6.1. Дискодиффузионный метод. Постановка метода.
Используют для оценки эффективности препаратов в клинических условиях. Для определения чувствительности методом диффузии в агар берут 18-20-часовую чистую культуру бактерий, выросших на плотной питательной среде. Затем из 5-10 изолированных колоний данной культуры готовят суспензию в физиологическом растворе в концентрации 1,5 х 108 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 см3. Концентрацию бактерий оценивают с помощью стандарта мутности по оптической плотности. Оптическая плотность бактерий с концентрацией 1,5 х 108 равна 5 или 10 единицам.
Далее 1-2 мл взвеси микробов сразу после приготовления сеют на поверхность агаровой среды, равномерно распределяя путем покачивания чашки. Избыток жидкости удаляют пипеткой. Чашки подсушивают приоткрытыми при комнатной температуре в течение 10-15 минут.
Затем на поверхность засеянной питательной среды стерильным пинцетом наносят диски, пропитанные антибиотиками, на одинаковом расстоянии друг от друга, приблизительно на расстоянии 2 см от края чашки (не более 6 дисков на чашку).
Использование распределителя дисков делает процедуру нанесения дисков менее трудоемкой, корректно располагает диски как по отношению друг к другу, так и к краям чашки Петри, а также исключает такие проявления «человеческого» фактора, как сдвигание диска, неравномерное прижатие и т.д. Для решения большинства прикладных задач лучше всего подходит 7-дисковый диспенсер, наносящий 6 дисков по периметру чашки диаметром 90 мм и один в центре.
Чашки ставят в термостат при 35-37 ˚С у дном, на 24 часа.
После инкубации измеряют диаметры зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр дисков до 1 мм. Иногда в зоне задержки роста могут быть обнаружены очень мелкие колонии, которые выявляются при определенных условиях освещения. На них не следует обращать внимания.
Края зон могут быть не резко очерчены, зоны могут иметь двойные контуры. В этих случаях диаметр зоны измеряют по наиболее четкому контуру. Если по периферии зоны имеются большие колонии, то границы зоны определяются внутренним краем колоний этой группы.
Если крупные колонии имеются по всей зоне, то, возможно, культура загрязнена, и анализ надо повторить. Если культура чистая, то наличие таких колоний позволяет думать о гетерорезистентной популяции.
При определении чувствительности к антибиотикам протеев, обладающих ползучим ростом, зона задержки роста может быть покрыта тонкой пленкой, которая не мешает определению диаметра зоны.
Оценку результатов проводят по таблице, в которой приведены пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно чувствительных и чувствительных микроорганизмов и значений МПК (минимальная подавляющая рост концентрация антибиотика) для устойчивых и чувствительных штаммов.
Полученные результаты по измерению диаметров зон задержки роста исследуемых культур сопоставляют с пограничными значениями в таблице и относят к соответствующей категории чувствительности.
В лабораторной практике используют современные автоматические приборы - анализаторы, предназначенные для учета и оценки результатов дискодиффузионного метода, такие как «Адажио» и BIOMIC V3.