1. Выделение днк

Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации. В качестве источника матричной ДНК может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал, сохранивший в своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных молекул ДНК. Для специфической амплификации, наряду с очищенной ДНК, используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины хориона, соскобы букальных клеток и смывы из полости рта, луковицы корней волос, культуры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие неприкрепившиеся и не давшие роста клетки, соскобы с цитогенетических препаратов и длительно хранившиеся фиксированные ткани, полученные при паталогоанатомическом анализе. Иногда бывает достаточно прокипятить образец в течение 5-10 минут, однако в большинстве случаев требуются более трудоемкие методы.

Этап подготовки пробы биологического материала

На данном этапе должны выполняться общие требования, предъявляемые к взятию биологического материала и его транспортировке, строго соблюдаться температурный режим.

- кровь собирается в пробирки с антикоагулянтом (ЭДТА-этилендиаминтетрауксусная кислота, глюгицир), после взятия образца, пробирки необходимо перемешать, чтобы не допустить свертывания образца. Не встряхивать!

- цельная кровь должна быть охлаждена, но не заморожена;

- если ДНК из образцов ткани не может быть экстрагирована в ближайшие 48 часов, биологический образец должен быть заморожен до температуры -20^оС…-80^оС, либо подвергнут криозаморозке;

- повторение циклов замораживания-оттаивания не рекомендуется из-за возможности разрушения ДНК;

- исключить вероятность контаминации (загрязнения) собранного биологического материала.

Методы выделения днк

- экстракция с помощью органических растворителей (фенол-хлороформная экстракция);

- экстракция с помощью силики (диоксид кремния);

- экстракция с помощью гель-фильтрации;

- экстракция с помощью магнитных частиц;

- экстракция на микроцентрифужных колонках;

- экстракция с помощью ионной смолы (Chelex);

- экстракция на бумажных фильтрах.

Выбор методики зависит от поставленной задачи, времени анализа и степени очистки.

Основные этапы методов выделения днк

- лизис клеток;

- лизис ядра;

- удаление из полученного материала ингибиторов, инактивация клеточных нуклеаз;

- отделение искомых НК от клеточной массы;

- очистка и концентрирование ДНК.

Процедура лизиса включает:

- механическое разрушение (например, применение пестика, применение ультразвука, осмотическим шоком);

- химическая обработка (например, лизис с помощью детергентов, хаотропных агентов (веществ, способствующих нарушению трехмерной структуры макромолекул и их денатурации), или тиоловое восстановление).

- ферментативное расщепление белков (например, с помощью протеиназы К);

В зависимости от типа биологического материала лизис клеток осуществляется различными способами. Механическое разрушение наиболее часто используемый способ разрушения клеток биоматериала. В случае работы с растительными и бактериальными клетками возникает необходимость применения дополнительных компонентов для избавления от клеточной стенки (лизирующие ферменты, детергенты и т. д.). После разрушения образца возникает необходимость очистки нуклеиновых кислот от других компонентов клеток. Для этого существуют различные методы, основанные на специфических свойствах нуклеиновых кислот (НК). Наиболее часто используется очистка НК методом фенол-хлороформной экстракции, основанной на различной растворимости НК в растворителях разной природы.