Введение

Стремительное развитие технологий высокопроизводительных генетических исследований дало возможность иначе взглянуть на подходы к получению информации о геноме человека. Молекулярно-генетические методы исследования, постоянно совершенствующиеся в последние десятилетия, значительно облегчили проведение диагностики наследственных и инфекционных заболеваний. С каждым годом появляются новые методологические подходы, открывающие огромные перспективы успешного поиска генетических маркеров и факторов развития как моногенных, так и многофакторных заболеваний человека. Несмотря на то, что методы данной группы, как правило, весьма сложны, трудоемки и дорогостоящи, данные, полученные в процессе ДНК-диагностики намного точнее и информативнее результатов других анализов. Медико-биологическое сообщество уже осознало важность изучения генетической основы заболеваний, а также возможность диагностики и начала лечения болезни до появления ее симптомов. Знание теоретических основ и владение данными технологиями необходимо для успешной профессиональной деятельности специалиста в области генетики.

Учебное пособие создано в связи с необходимостью представить методологию молекулярно-генетического исследования в виде отдельного руководства, в котором можно найти основные необходимые в практической работе данные по методам исследования ДНК человека студентам биологических факультетов, а также аспирантам и научным сотрудникам молекулярно-генетических лабораторий. В данном учебном пособии методы рассматриваются в соответствии с последовательностью их проведения, начиная с выделения ДНК и РНК, ПЦР, гель-электрофореза, заканчивая методом ПДРФ, SSCP, секвенирования, микрочипирования. Предложены методики проведения экспериментов, даны комментарии для успешного выполнения лабораторных работ и научных исследований. Особое внимание уделяется наиболее современным модификациям молекулярно-генетических методов исследования, таким как полногеномное генотипирование полиморфных локусов с помощью микрочипов высокой плотности, методы полногеномного секвенирования, различные модификации ПЦР в реальном времени и др. Данное учебное пособие поможет студентам успешно освоить методы молекулярно-генетического анализа и применять их при выполнении научных исследований, курсовых и дипломных работ, а также обобщить знания при подготовке к экзаменам.

1. Выделение нуклеиновых кислот

Для проведения молекулярного анализа нуклеиновых кислот, нужно, прежде всего, получить их в чистом виде. Если источником НК служит клинический образец, то необходимо подобрать оптимальные методы выделения, позволяющие получить максимальное количество высокочистого продукта.

Типичная диплоидная клетка человека в норме содержит примерно 7 пг геномной ДНК и разное количество митохондриальной ДНК. Таким образом, суммарный продукт, выделяемый из клинических образцов, представляет собой смесь геномной и митохондриальной ДНК. Получить чистую геномную ДНК можно только одним способом: выделением ядер и освобождением из них ДНК. Впрочем, в большинстве случаев эксперименты можно проводить на суммарной ДНК, поскольку митохондриальная ДНК обычно не мешает анализу.

Типичная клетка млекопитающих содержит около 15 пг РНК. Из них 80-85% приходится на долю рибосомной (28S, 18S, 5S) РНК, а остальная часть представлена в основном низкомолекулярными РНК (транспортными и малыми ядерными). И лишь 1-5% суммарной РНК составляет информационная РНК (мРНК), гетерогенная как по размеру, так и по первичной структуре. В большинстве случаев на 3’-конце мРНК эукариот находится poly(A)-«хвост».