- •© БашГу, 2013 содержание
- •Введение
- •Выделение нуклеиновых кислот
- •Выделение днк
- •Этап подготовки пробы биологического материала
- •Методы выделения днк
- •Основные этапы методов выделения днк
- •Выделение днк фенол-хлороформной экстракцией
- •Методика выделения днк методом фенол-хлороформной экстракции из лейкоцитов крови (Mathew c.C., 1984).
- •Выделение днк с помощью сорбента
- •Выделение днк с помощью бумажных фильтров
- •Выделение рнк
- •Выделение рнк из цельной крови
- •Методика выделения рнк из цельной крови (с использованием набор реагентов ооо нпф «Литех»):
- •Выделение рнк из тканей с использованием тризола
- •Количественный и качественный анализ нк
- •Полимеразная цепная реакция синтеза днк и ее модификации
- •Механизм, компоненты и методика проведения пцр Механизм пцр
- •Этапы пцр
- •Компоненты реакционной пцр-смеси
- •Основные принципы работы пцр-лаборатории
- •Рекомендации по оборудованию лаборатории
- •Рекомендации по подготовке к постановке пцр
- •Стандартная методика для проведения пцр
- •Методика проведения пцр
- •Проблема контаминации
- •2.2. Пцр в режиме реального времени
- •Принципы пцр в «реальном времени»
- •Различные типы пцр «в реальном времени»
- •Использование интеркалирующих агентов
- •Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку пцр-продукта
- •Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).
- •Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons)
- •Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay)
- •Сравнение методов sybr Green и TagMan
- •Материально-техническое обеспечение (Используемое оборудование и материалы для проведения пцр «в реальном времени»)
- •Основные этапы работ
- •Базовые параметры реакции
- •Базовый протокол TaqMan амплификации
- •Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени
- •Способ учета результатов
- •Анализ результатов
- •Пример протокола реакции для амплификатора Bio-Rad cfx 96
- •Пцр с обратной транскрипцией
- •Протокол проведения процедуры обратной транскрипции
- •Электрофорез днк
- •Методика заливки агарозного геля
- •Определение концентрации и качества днк/мРнк в агарозном геле
- •Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (пдрф-анализ)
- •5. Анализ конформационного п олиморфизма однонитевой днк (sscp-анализ)
- •6. Секвенирование
- •Порядок подготовки образцов днк к секвенированию.
- •1Мкл буфер BigDye
- •Современные методы полногеномного секвенирования днк
- •5. Метод биочипов
- •Основные технологии производства днк-микрочипов
- •Оценка экспрессии генов с помощью днк микрочипов (на примере Affymetrix GeneChip)
- •Полногеномное генотипирование полиморфных локусов с помощью микрочипов высокой плотности (на примере Illumina Human610-Quad BeadChip)
- •Список использованной литературы
- •Приготовление рективов для выделения днк Приготовление лизирующего буфера
- •Приготовление Трис-нСl 2 m (pH 7,6)
- •Приготовление 0,5 м эдта (рН 8,0)
- •Приготовление Soline (эдта)
- •Приготовление 5 м NaCl
- •Приготовление 10% sds (додецил сульфат натрия)
- •Приготовление фенола
- •Компоненты и реактивы для прведения электрофореза днк
- •Приготовление реактивов, неоходимых при проведении sscp-анализа
- •Триплетный генетический код
- •Биолоические базы данных
министерство образования и науки рф
БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА
Учебное пособие
Уфа
РИЦ БашГУ
2013
УДК 575+577
ББК 28.04+28.070+28.704+52.5
М
Печатается по решению учетно-методической комиссии биологического факультета Башкирского государственного университета,
протокол №7 от 21.06.2013г.
Рецензенты: ИБГ УНЦ РАН, проф., д-р биол. наук, О.Е.Мустафина (г.Уфа);
кафедра биологии Башкирского государственного
медицинского университета», (г.Уфа)
Нургалиева А.Х., Карунас А.С., Хусаинова Р.И., Хидиятова И.М., Ахметова В.Л., Валиев Русл.Р., Надыршина Д.Д., Мустафин Р.Н., Мурзабаева С.Ш., Хуснутдинова Э.К.
Молекулярно-генетические методы изучения наследственных болезней человека: учеб. пособие – Уфа: РИЦ БашГУ, 2013. – 102с.
Пособие предназначено дня студентов биологического факультета, специализирующихся на кафедре генетики и фундаментальной медицины БашГУ. Издание составлено с учетом учебной программы курса лекций и практических занятий по дисциплине «Большой практикум». Цель учебного пособия – ознакомление с основными молекулярно-генетическими методами изучения наследственных болезней человека и методикой их проведения. Описаны методы выделения нуклеиновых кислот, ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, ПДРФ-анализ, гель-электрофорез, секвенирование и др. Даны некоторые комментарии к методикам для успешного выполнения лабораторных работ и научных исследований.
© БашГу, 2013 содержание
Введение………………………………………………………………....
Список использованной литературы…………………………………..
Приложение…………………………………………………………….. |
5 7 7 15
19 21 38 57
62
69
72
74
82
96
98
|
Список сокращений
дНТФ (dNTP) - кДНК – ЛУК – |
Дезоксинуклеозидтрифостаты Комплиментарная ДНК Ледяная уксусная кислота |
МБА – Мл мкг |
Метиленбисакриламид
|
НП – нм НК – ОТ – |
Нуклеотидные последовательности
Нуклеиновая кислота Обратная транскрипция |
ПДРФ – пг |
Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
|
п.н. – |
Пар нуклеотидов |
ПСА – |
Персульфат аммония |
ТАЕ – |
Трис-ацетат-ЭДТА |
ТВЕ – |
Трис-борат-ЭДТА |
Трис – |
Трис-(оксиметил)-аминометан (2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол) |
ЭДТА – |
Этилендиаминтетраацетат |
CAPS – |
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (Рестрикционный полиморфизм амплифицированных последовательностей) |
CCM – |
Chemical Cleavage of Mismatch (Метод химического расщепления неспаренных оснований) |
DGGE – |
Denaturating Gradient Gel Electrophoresis (Денатурирующий градиентный гель-электрофорез) |
DHPLC – |
Denaturation High Performance Liquid Chromatography (Денатурирующая жидкостная хроматография высокого разрешения) |
FISH – |
Метод флюоресцентной гибридизации in situ |
SDS – |
Додецилсульфат натрия |
SNP – |
Single Nucleotide Polymorphism |
SSCP – μМ |
Single Strand Conformation Polymorphism |
|
|
|
|