Лабораторная работа №5

Тема: ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ПРИЗНАКОВ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ И ДРОЖЖЕЙ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ «РАЗДАВЛЕННАЯ КАПЛЯ»

Цель работы: Ознакомиться с морфологическими особенностями грибов и дрожжей. Освоить технику микроскопического исследования грибов и дрожжей в препаратах «раздавленная капля».

Оборудование, материалы: Микроскоп; препаровальные иглы и бактериологические петли; предметные и покровные стекла; фильтровальная бумага; спиртовка; кристаллизационная чашка; лоток с рельсами для предметных стекол; культуры грибов родов Mucor, Aspergillus, Penicillium, Alternaria; чистая культура дрожжей Saccharomyces cerevisiae; физраствор; дисц. вода; марлевые салфетки; муравьиный спирт; маркер по стеклу.

Порядок выполнения работы

На занятии студенты изучают морфологические признаки грибов и дрожжей, их культуральные свойства, знакомятся с представителями отдельных классов. Осваивают методику приготовления препаратов «раздавленная капля» и технику микроскопирования живых неокрашенных объектов.

Приготовление препаратов типа «раздавленная капля»

1. На предметное стекло трубочкой или пипеткой наносят большую каплю физраствора;

2. Зажигают спиртовку, прокаливают препаровальную иглу над пламенем горелки и отбирают небольшое количество мицелия из пробирки или чашки Петри, соблюдая правила асептики;

3. Мицелий аккуратно помещают в каплю, нанесенную на предметное стекло и с помощью двух игл расправляют его в воде;

4. Препарат накрывают покровным стеклом и слегка придавливают. Излишки воды удаляют с помощью фильтровальной бумаги.

5. Микроскопируют препарат «раздавленная капля» сначала с объективом х8, а затем х40 в затемненном поле зрения (конденсор опущен, шторка ирис-диафрагмы прикрыта).

При отборе и микроскопии препаратов грибов учитывают следующие рекомендации:

а) гриб рода Mucor. Отбирают черновато-серый пушистый воздушный мицелий. При микроскопии обращают внимание на гифы с заполненными спорами спорангиями и колонки, которые образуются при освобождении спорангия;

б) гриб рода Aspergillus. Отбирают немного пушистого мицелия с окрашенными конидиями, слегка углубляясь иглой в питательную среду. Обращают внимание на несептированные конидиеносцы;

в) гриб рода Penicillium. При отборе стараются взять молодой мицелий (на границе окрашенного и белого мицелия), углубляясь иглой в среду. Обращают внимание на септированные гифы с кисточками.

г) гриб рода Alternaria. Берут грибницу в черных участках, углубляясь в нее иглами. Обращают внимание на септированный мицелий, слабо развитые конидиеносцы и крупные конидии, имеющие вид округлых или заостренных многоклеточных образований, напоминающих «гранаты-лимонки».

При исследовании дрожжей на предметное стекло наносят суспензию дрожжей, накрывают покровным стеклом, излишки воды удаляют фильтровальной бумагой. Микроскопируют препарат и объективом х8 и х40.

Оформление и анализ результатов исследований.

В отчете студенты кратко конспектируют теоретический материал. Зарисовывают микроскопические картины исследованных культур грибов и дрожжей с учетом морфологических особенностей каждого микроорганизма. Под каждым рисунком подписывают латинское название и увеличение препарата. Описывают культуральные свойства изучаемых грибов.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6

Тема: ВЛИЯНИЕ НА МИКРООРГАНИЗМЫ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ. ПОНЯТИЯ «АСЕПТИКА» И «АНТИСЕПТИКА».

Цель работы: Знать способы стерилизации и дезинфекции. Уметь подготавливать материал к стерилизации, уметь проводить дезинфекцию рук, рабочего места, патологического материала.

Оборудование и материалы: аппаратура для стерилизации: стерилизатор паровой (автоклав), сухожаровой шкаф, химические и биологические тесты, индикаторы стерилизации; пинцет, вата, бинты, ножницы; дезинфицирующие средства.

І. КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Микроорганизмы подвержены постоянному воздействию факторов внешней среды. Влияние этих факторов может быть благоприятным либо не благоприятным. Неблагоприятные воздействия могут привести к гибели микроорганизмов, то есть оказывать микробицидный эффект, либо подавлять размножение микробов, оказывая статическое действие.

Физические факторы.

Температура.

Микробы приспосабливаются к изменениям температуры окружающей среды. Выделяют оптимальную температуру (благоприятную для роста и размножения), минимально и максимально приемлемые ( за их пределами рост прекращается). По отношению к температурным условиям микроорганизмы разделяют на мезофильные, психрофильные и термофильные.

- мезофильные виды лучше растут в пределах 20-40 ⁰С, к ним относится большинство патогенных и условно-патогенных микроорганизмов;

- термофильные виды растут при температуре выше 40 ⁰С, верхний предел 70 ⁰С;

- психрофильные виды растут в диапазоне температур 0-10 ⁰С, к ним относится большинство сапрофитов, обитающих в почве, в пресной и морской воде

Химические вещества, которые пагубно влияют на микроорганизмы, но не влияют на макроорганизмы, и которые используют лечения инфекционных болезней, называют антисептиками.

Антисептика – это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение или угнетение их роста на обьекте (рана, организм). С этой целью используют бактерицидные химические вещества.

Асептика – система профилактических мероприятий (дезинфекция, стерилизация), направленная на предупреждение микробному заражению ран, операционного поля, культуры микроорганизмов и др.

Для проведения дезинфекции и стерилизации используют разные методы в зависимости от того, какой режим стерилизации они обеспечивают.

Стерилизация — обработка объектов, при которой достигается полное уничтожение всех микроорганизмов. В результате стерилизации объект становится свободным как от патогенных, так и от сапрофитных микробов. Существуют различные методы и способы стерилизации, в основе которых лежит действие физических или химических факторов. Критерием гибели микроорганизмов является необратимая утрата способности к размножению, что можно оценить путем количественного подсчета числа колоний после высева смывов на чашки с питательными средами.

Наиболее широко применяют методы тепловой стерилизации: кипячением, сухим жаром в атмосфере горячего воздуха или влажным жаром при помощи пара, а также прокаливанием предметов в огне.

Прокаливание на огне — надежный метод стерилизации бактериологических петель, металлических и стеклянных предметов. Однако применяется ограниченно ввиду их порчи.

Стерилизация сухим жаром или горячим воздухом производится в сушильных шкафах или печах Пастера при температуре 160—170°С в течение 1—1,5 ч по достижении заданной температуры. Этим методом стерилизуют лабораторную посуду, инструменты, минеральные масла, вазелин. Жидкости и резину сухим жаром стерилизовать нельзя. Предметы, подлежащие стерилизации, заворачивают в бумагу или закладывают в металлические пеналы для предохранения от последующего загрязнения. Необходимо помнить, что при темпера-, туре выше 170°С начинается обугливание бумаги, ваты, марли, а при более низкой температуре не происходит гибели спор.

Стерилизация кипячением в течение 30 мин убивает вегетативные формы микробов. Споры многих бактерий при этом сохраняются, выдерживая кипячение в течение нескольких часов. Для уничтожения вирусов — возбудителей болезни Боткина необходимо кипячение в течение 45—60 мин. Кипячению в специальных стерилизаторах подвергают шприцы, хирургические инструменты, иглы, резиновые трубки. Для повышения точки кипения и устранения жесткости воды добавляют 2% гидрокарбоната натрия.

Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование) является наиболее надежным и быстрым методом стерилизации. Обеспложивание достигается воздействием пара, температура которого под давлением выше, чем температура кипящей воды: при давлении 0,5 атм 112°С, при 1 атм. 121 °С , при 1,5 атм 127°С и при 2 атм 134°С.

Стерилизацию производят в автоклаве. Он представляет собой двухстенный металлический котел, покрытый снаружи кожухом и имеющий герметически закрывающуюся крышку. В современных горизонтальных автоклавах под рабочим котлом находится бачок с водомерным стеклом и электронагревательными элементами, куда наливают воду до определенной метки на водомерном стекле. Вода нагревается и образующийся при этом пар по специальному патрубку, соединенному с котлом автоклава, поступает в рабочую камеру котла. Пар постепенно вытесняет из рабочей камеры воздух, который выходит наружу через специальный выпускной кран. После того как воздух будет полностью вытеснен из рабочей камеры паром и из выпускного клапана пойдет насыщенный «сухой пар», крышку герметически закрывают. Пар доводят до нужного для стерилизации давления, которое определяют по имеющемуся на автоклаве манометру, и проводят стерилизацию в течение 20 мин. По окончании стерилизации автоклав отключают, ждут, пока давление не снизится до нуля, выпускают постепенно пар и открывают автоклав. Для контроля надежности работы автоклава и режима стерилизации применяют физические, химические методы и бактериологические тест-объекты. В автоклаве обычно стерилизуют при давлении 1 — 1,5 атм различные питательные среды, растворы, белье, резину, перевязочный материал и др. При давлении 2 атм обеззараживают инфицированный материал и отработанные культуры микробов. Стерилизация в автоклаве таких веществ, как вазелин, масло, песок, малоэффективна вследствие того, что в них пар проникает плохо или совсем не проникает. Некоторые питательные среды (например, содержащие сахара) нельзя стерилизовать паром под давлением, так как они карамелизуются, поэтому их подвергают дробной стерилизации текучим паром.

Стерилизация текучим паром проводится в аппарате Коха или в автоклаве при не завинченной крышке и открытом выпускном кране. На дно аппарата Коха наливают воду и нагревают до 100°С. Образующийся пар движется вверх через заложенный материал и стерилизует его. Так как однократное действие паров воды не убивает споры, применяют дробную стерилизацию — 3 дня подряд по 30 мин. Споры, не погибшие при первом прогревании, прорастают до следующего дня в вегетативные формы и погибают при втором и третьем прогревания.

Для веществ, разрушающихся при 100°С (например, жидкости содержащие белок), применяют другой вид дробной стерилизации — тиндализацию. Стерилизуемое вещество прогревают на водяной бане по 1 ч при 56— 60°С в течение 5—6 дней. Для освобождения от вегетативных форм микробов прибегают к пастеризации — однократному прогреванию при 70°С в течение 30 мин с последующим быстрым охлаждением и хранением на холоду, чтобы не проросли споры. Этот метод применяют для обеззараживания и сохранения молока.

Стерилизация фильтрованием (холодная стерилизация) через бактериальные фильтры применяется для освобождения жидкостей от бактерий. Этот метод используют в тех случаях, когда стерилизующая жидкость портится от нагревания, при необходимости отделения бактериальных клеток от растворимых продуктов их жизнедеятельности (экзотоксины, антибиотики и др.), фагов, вирусов. Бактериальные фильтры изготовляют из фарфора, каолина, мелко пористого стекла пирекс, асбеста, целлюлозы, нитроклетчатки и других мелкопористых материалов. В механизме стерилизации фильтрованием играют роль размер пор и адсорбция микробов на стенках пор фильтров. Фильтры имеют форму свечей (Шамберлана, Беркефельда) или пластинок из асбеста, нитроцеллюлозы (мембранные фильтры), которые вкладывают в специальные фильтровальные приборы (аппарат Зейтца, прибор Рублевской водопроводной станции). Перед работой их стерилизуют. Фильтрацию производят с разрежением воздуха внутри сосуда-приемника.

Химическая стерилизация применяется в том случае, если объекты нельзя автоклавировать. Обычно это питательные среды, содержащие термолабильные вещества. Химическое вещество должно быть не только токсичным, но и летучим для быстрого исчезновения из простерилизованного объекта. Наилучшим является окись этилена — жидкость кипящая при 10,7°С. Окись этилена в жидком виде добавляют в раствор при температуре от 0 до 4°С в конечной концентрации 0,5—1%. При температуре выше точки кипения окись этилена используют как стерилизующий газ, для стерилизации сложной медицинской аппаратуры. Окись этилена губительно действует на вегетативные и споровые формы бактерий. Ее используют в промышленности для стерилизации пластмассовых чашек Петри и других предметов, которые плавятся при температуре выше 100°С. Применение окиси этилена ограничено, так как вещество токсично, нестойко, взрывоопасно.

Дезинфекция — уничтожение патогенных микробов в окружающей человека среде. Методы и способы дезинфекции. различны, но они преследуют цели уничтожения не всех микроорганизмов, а только патогенных. Уничтожение возбудителей инфекционных заболеваний в переносчиках называют дезинсекцией, а в организме грызунов — источников инфекции — дератизацией.

Дезинфекция имеет большое значение в системе профилактических и противоэпидемических мероприятий. С учетом роли дезинфекции ее делят на профилактическую и очаговую. Профилактическая дезинфекция позволяет предупредить распространение инфекционных болезней среди населения. Такой вид дезинфекции проводят в пищевых объектах, местах торговли пищевыми продуктами, на предприятиях по переработке животного сырья, в местах общественного пользования, в сооружениях водоснабжения, медицинских учреждениях, бактериологических лабораториях. Очаговая дезинфекция осуществляется в эпидемическом очаге: в больнице или дома, где находится больной (текущая дезинфекция) либо после госпитализации, выздоровления или смерти больного (заключительная дезинфекция). Задачей текущей дезинфекции является обеззараживание выделений больного (испражнения, моча, рвотные массы, мокрота) или предметов домашнего обихода, на которые могли попасть патогенные микробы. Она исключает заражение лиц, общающихся с больным. Задача заключительной дезинфекции — обеззаразить объекты, с которыми соприкасался больной (помещение, предметы обстановки и ухода, белье, одежда, остатки пищи и др.).

При выполнении различных видов дезинфекции применяют механические, физические и химические способы и средства. К первым относятся мытье рук с мылом и щеткой, влажная уборка помещений, стирка белья, проветривание помещений и др., преследующие цель удаления микроорганизмов с объекта. Физические способы: кипячение, сжигание, обработка паром (текучим и под давлением) с использованием автоклава и дезинфекционных камер, приводят к уничтожению патогенных микробов. Применение химических дезинфицирующих средств целесообразно сочетать с механическими способами и действием физических факторов.