Лабораторная работа № 3-4

Тема: ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ. ОРГАНЫ ДВИЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ. СПОРЫ БАКТЕРИЙ. СЛОЖНЫЕ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ БАКТЕРИЙ

Цель работы: Ознакомиться с морфологическим разнообразием бактерий и основными признаками, используемыми при их идентификации. Изучить различные сложные и дифференциальные методы окраски бактерий и их структур и разобраться в сущности этих методов и цели их использования. Освоить технику окраски бактерий по Граму, капсул бактерий по Бурри-Гинсу, спор бактерий по Цилю-Нильсену и Шефферу-Фултону.

Оборудование, материалы: Микроскоп; бактериологические петли; предметные стекла; чашки Петри; штатив с пробирками; спиртовка; кристаллизационная чашка; иммерсионное масло; фильтровальная бумага; набор красок для окраски по Граму (фильтровальные бумажки с генциан-фиолетовым или метил-фиолетовым, растворы Люголя и фуксина Пфейффера); набор красок для окраски по Цилю-Нильсену (фуксин Циля, сульфатная или соляная кислота, разведенный метиленовый синий); 96 %-ный этиловый спирт: лоток с рельсами для предметных стекол; чистые культуры бактерий, дисц.вода; пипетка; марлевые салфетки; муравьиный спирт; маркер по стеклу.

. Порядок выполнения работы

На занятии студенты знакомятся с основными признаками, которые учитываются при идентификации микроорганизмов, обращают внимание на морфологические признаки кокков и палочек, диагностическое значение сложных и дифференциальных методов окраски бактерий. Осваивают технику окраски бактерий по методу Грама. Определяют, какие из представленных для исследования бактерии относятся к грамположительным, а какие к грамотрицательным. Готовят фиксированный мазок из чистой культуры спорообразующих бактерий и окрашивают его по Цилю-Нильсену.

1 Окраска бактерий по методу Грама

Сущность метода заключается в различии химического состава и строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Клеточная стенка грам+ бактерий толстая, но однослойная, содержит много пептидогликана – муреина, а также тейховые кислоты, которые образуют прочное соединение с красителями - генцианвиолетом и йодом и поэтому остаются окрашенными после обработки мазка спиртом. Таким образом, грам+ бактерии по методу Грама окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.

У грам ^- бактерий клеточная стенка тонкая, но двухслойная. Муреина мало, причем он содержится во внутреннем слое клеточной стенки, тейхоевые кислоты отсутствуют. Внешний слой клеточной стенки содержит, главным образом, вещества, обладающие гидрофобными свойствами – липополисахариды и липопротеиды. Эти вещества не образуют прочного комплекса с красками генцианвиолетом и йодом и поэтому клетки обесцвечиваются после обработки 96 %-ным этиловым спиртом и после дополнительной окраски красителем фуксином окрашиваются в бледно-розовый цвет.

Техника окраски по Граму

1. На предметном стекле готовят фиксированный мазок исследуемой чистой культуры;

2. Мазок окрашивают красителем генцианвиолетом через полоску фильтровальной бумаги. Можно также использовать заранее приготовленные фильтровальные бумажки, смоченные 1 %-ным спиртовым раствором кристаллвиолета и высушенные (метод Грама в модификации А.В. Синева). В этом случае бумажки помещают на фиксированный мазок и смачивают несколькими каплями воды. Окраску препарата проводят в течение 2…3 мин;

3. Фильтровальную бумагу снимают с мазка, краску сливают и наносят на мазок раствор Люголя на 2 мин;

4. Раствор Люголя сливают с мазка и обрабатывают 96 %-нам спиртом в течение 30…60 сек. Затем препарат промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой;

5. Мазок окрашивают красителем фуксином 2…3 мин, второй раз промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.

Затем на стекло наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают препарат с объективом х90 или х100 при максимальном освещении.

2.Окраска кислотоустойчивых бактерий по Цилю-Нильсену.

Для определения кислотоустойчивых микобактерий туберкулеза, лепры, а также некоторых актиномицетов применяют окраску препаратов по Цилю-Нильсену. У этих микроорганизмов в клеточной стенке находится много (около 40%) липидов, воска, оксикислот, что обеспечивает их устойчивость к кислотам, щелочам и спиртам. Она также малопроницаема для разведенных красителей, поэтому для окраски используется концентрированный краситель (Фуксин Циля). Окраску производят при нагревании (в кипящем шаре). При таких условиях все элементы препарата (клетки микроорганизма, посторонняя микрофлора и кислотоустойчивые микобактерии) приобретают красный цвет. После обработки препарата сульфатной кислотой и водой кислотоустойчивые микобактерии остаются красного цвета, а все остальные элементы препарата обесцвечиваются. Вторым красителем, разведенным метиленовым синим, окрашивают без подогревания, поэтому он в середину клетки кислотоустойчивых микобактерий не попадает и они не изменяют свой красный цвет. Все остальные обесцвеченные элементы препарата приобретают синий цвет.

Техника окраски по Цилю-Нильсену

1. На краю предметного стекла (на расстоянии примерно 1,5-2,0 см от края) готовят мазок из культуры кислотоустойчивых бактерий;

2. Кладут на него фильтровальную бумагу, хорошо смоченную фуксином Циля, и нагревают над пламенем горелки до появления пара. Нельзя допускать прикипания краски к мазку. Поэтому препарат периодически отстраняют от пламени и добавляют новую порцию краски. Нагревание мазка с краской проводят в течение 7 мин;

3. Краску сливают, препарат быстро промывают дисцилированной водой и просушивают фильтровальной бумагой;

4. Препарат обрабатывают 1 % раствором сульфатной кислоты (соляной кислотой) на протяжении 15-30 сек и промывают водой;

5. Окрашивают мазок дополнительно мителеновым синим 2…3 мин, затем краску сливают, мазок промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.

Далее на мазок наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают под объективом на х90 или х100 при максимальном освещении.

3. Окраска спор бактерий по Шефферу-Фултону

Сущность метода заключается в комбинированном действии концентрированного раствора красителя бриллиантового зеленого и температуры на малопроницаемую оболочку спор с дальнейшим обесцвечиванием цитоплазмы вегетативной клетки и ее контрастным докрашиванием сафранином. Таким образом, споры окрашиваются в зеленый цвет, а клетки – в красный.

Техника окраски по Шефферу-Фултону

6. На краю предметного стекла (на расстоянии примерно 1,5-2,0 см от края) готовят густой нефиксированный мазок из чистой культуры спорообразующих бактерий;

7. На раствор наносят водный раствор бриллиантовой зелени, и мазок с краской нагревают над пламенем горелки до появления пара. Нельзя допускать прикипания краски к мазку. Поэтому препарат периодически отстраняют от пламени. Нагревание мазка с краской проводят в течение 3 мин;

8. Краску сливают, препарат быстро промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой;

9. Окрашивают мазок раствором сафранина 2…3 мин, затем краску сливают, мазок вторично промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.

Далее на мазок наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают под объективом на х90 или х100 при максимальном освещении.

Оформление и анализ результатов исследований. В отчете студенты кратко конспектируют теоретический материал и переписывают сущность и технику окраски бактерий по Граму, капсул и спор бактерий по Цилю-Нильсену и Шефферу-Фултону. Зарисовывают микроскопические картины исследованных чистых культур бактерий с учетом морфологических особенностей каждого микроорганизма.