5. Морфогенез растений invitro и exvitro. Культура протопластов, клеток, тканей и органов. Практическое использование культур растительных клеток.

Морфогенез («формообразование») — возникновение и развитие органов, систем и частей тела организмов.

Invitro («в стекле») – технология выполнения экспериментов, когда опыты проводятся «в пробирке», вне живого организма.

Exvitro(«из стекла») – организм, выращенный из культуры ткани. Морфогенез при этом проходит уже в открытой системе.

Эксплант— группа клеток, отделенная от материнского организма.

Морфофизиологическая характеристика растительных клеточных культур:

В основе культивирования растительных клеток лежит свойство тотипотентности, благодаря которому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть обеспечить развитие всего растения. При этом растительная клетка менее требовательна к условиям культивирования, чем животная.

Индуцирующее воздействие могут оказывать различные факторы: гормоны, продукты жизнедеятельности соседних клеток, других тканей, электрофизиологические сигналы и т. д.Изменяя условия можно вызвать дифференциацию недетерминированных клеток. Культура растительной ткани позволяет получить многочисленные популяции в сравнительно короткое время и в ограниченном пространстве.

Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей различных органов высших растений - корней, листьев, стеблей, пыльников, зародышей (экспланты) помещают invitro на искусственную среду, содержащую ауксины (фитогормоны).

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус. Каллусная тканьвозникает путем неорганизованной пролиферациидедифференцированных клеток органов растения. У растений в природе каллусная ткань возникает в исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует непродолжительное время; защищает место ранения, может накапливать питательные вещества для регенерации. Образование каллуса не всегда связано с травматическим воздействием, он может возникнуть и в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза из-за нарушения гормонального баланса. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности.

Клеткив культуре могут существовать в двух видах: в виде суспензии в жидкой питательной среде и на поверхности твердой питательной среды в виде каллуса. Поверхностное культивирование осуществляют на различных питительных средах (чаще - на полужидкой агаризованной среде.

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным.

Неорганизованно растущая каллусная ткань характеризуется тремя типами клеток: мелкими, средними и крупными. При пассировании (пересаживании) ткани на среду, содержащую индукторы органогенеза, мелкие клетки приступают к делению и формируют меристематические очаги. Деление клеток меристематического очага приводит либо к формированию почек и последующему развитию из них побегов (геммогенез), либо к ризогенезу. Клетки меристемы с самых ранних стадий развития отличаются от каллусных высоким содержанием РНК и белка. При образовании соматических эмбриоидовкаллусная клетка средних размеров обособляется, ограничивается плотной оболочкой, теряет крупные вакуоли; содержит крупное структурированное ядро с ядрышком. Клетка делится митотически, в результате чего возникают 2 клетки проэмбрио. Последующие деления клеток приводят к формированию шаровидного зародыша. Дальнейшее развитие соматического эмбриона ведет к регенерации целого растения с корнями и побегами.

В качестве ауксинов используют:

- 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д),

- a-нафтилуксусную кислоту (НУК),

- индолил-масляную кислоту (ИМК),

- индолилуксусную кислоту (ИУК)

в концентрации 0,5 - 10 мг/л, в зависимости от вида экспланта.

Одним из важнейших гормонов, применяемых при культивировании invitro является ауксин, который активирует деление и растяжение клеток. Проникая в клетки, ИУК связывается со специфическими рецепторами, оказывая влияние на функциональную активность мембран, полирибосом и работу ядерного аппарата. Установлено, что в плазмалемме ауксин индуцирует работу Н⁺-помпы, в результате чего матрикс клеточных стенок размягчается, что является необходимым условием для роста и растяжения клеток. Под влиянием ауксина уменьшается продолжительность различных периодов митотического цикла. Так, предполагается, что уменьшается продолжительность S - периода, G₁ - периода. Все это приводит к значительному ускорению темпов размножения клеток. Ауксин также стимулирует синтез белков. Это позволяет предположить существование в хроматине структурных генов, транскрипция которых специфически индуцируется ауксином. Кроме этого ауксин усиливает окислительную и фосфорилирующую активность митохондрий, в результате чего улучшается энергетическое и субстратное обеспечение процессов синтеза РНК и белков, репликация ДНК, а также осуществление самого митоза.

Процессу образования каллуса предшествует дедифференцировка тканей экспланта. При дедифференцировке ткани теряют структуру, характерную для их специфических функций в растении, и возвращаются к состоянию делящихся клеток. Если эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа, то имеет в своем составе эпидермальные клетки, клетки камбия, сосудистой системы, сердцевинной и первичной коровой паренхимы. Преимущественно пролиферируют клетки камбия, коры, сердцевинной паренхимы. Ткани одного и того же органа имеют разную способность к морфогенезу: например, флоэмная ткань корня моркови дает начало корням, а ксилемная - формирует эмбриоиды.

Культивирование одиночных растительных клеток:

Выращивание изолированных клеток складывается из двух этапов: 1) изолирование неповрежденной клетки растительной или каллусной ткани; 2) создание условий, благоприятных для ее роста и развития.

Получать отдельные клетки лучше из суспензионных культур или рыхлого каллуса. Однако при первых же попытках культивирования отдельных клеток возникла проблема: они вели себя иначе, чем их скопления в виде агрегатов в суспензии или каллусной массе. При ее решении возникла гипотеза о «факторе кондиционирования». Так было названо вещество, стимулирующее деление отдельных клеток. Было предложено несколько вариантов культивирования отд. клеток:

1. Метода «ткани – няньки» (1954 г., Мьюир, Хильденбранту, Райкер).

Клетку изолируют при помощи микроманипулятора из рыхлого каллуса непосредственно на кусочек фильтра размером 8*8 мм, помещенный на верхушку каллусной ткани, из которой была взята клетка (или культуры родственного вида). Каллус должен находится в фазе активного роста. В этом случае клетки на фильтре растут и делятся. По мере старения каллуса-няньки фильтр с клетками переносится на молодой каллус. Когда ткань из клетки достигает размеров 0,5 – 1 мм, то ее можно высаживать непосредственно на питательную среду.

2. Метод «кормящего слоя» (1959 г., Бергман). Для этого суспензионную культуру клеток того же вида, что и одиночная клетка (или близкого вида), фильтруют стерильно через один слой батиста (ячейки 0,3*0,1 мм). В результате получают суспензию, на 90% состоящую из отдельных клеток, ее смешивают с агаризованной питательной средой того же состава, что использовался при культивировании суспензии. Смесь разливают тонким слоем (1 мм) в чашки Петри. Агар разделял клетки, но не препятствовал обмену химическими сигналами между ними, а толщина слоя позволяла смотреть за их поведением под микроскопом.

3.Использованиестарой культуральной среды, уже содержащей фактор кондиционирования от предыдущей культуры.

4. Применение очень богатой питательной среды, например, среды Као и Михайлюка. При этом объем среды, в которую помещаются клетки, должен был минимальным (микрокапли объемом до 20 мкл).

Все эти способы культивирования позволяют клетке «ощущать» фактор кондиционирования: он либо вырабатывается в достаточном количестве клетками «кормящего слоя», «ткани – няньки», либо содержится в суспензии, где ранее культивировались клетки, либо не теряется в большом объеме среды. Таким образом, фактор, вызывающий деление клеток, вырабатывается самими клетками, но в небольшом количестве. И только увеличивая число клеток, вырабатывающих этот фактор, чтобы он не рассеивался в больших объемах питательной среды, или же уменьшая объем среды, в котором будет выращиваться клетка, можно заставить ее делиться.

Применение культур одиночных клеток: Отдельные клетки культивируют для получения клонов, изучения их генетической и физиологической изменчивости или стабильности. Кроме того, культивирование отдельных клеток позволяет изучать условия, определяющие возникновение стимулов к делению у клеток, изолированных от влияния других клеток популяции или ткани. Отдельные клетки также важны для клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. Обычно в такие клетки вводят маркерные гены, которые позволяют осуществлять селекцию. Отдельные клетки могут также служить моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и изолированной клетке.

Выделение и культивирование протопластов:

Выделение протопластов:

Впервые протопласты выделил Дж. Клеркер в 1892 г., который использовал механический способ. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:

• невысокая производительность,

• можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом,

• трудоемкость и длительность.

Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.

Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим:

• одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток),

• клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу,

• клетки не повреждаются,

• метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.

Выделение протопластов проводят в три этапа:

1. обработка ферментами,

2. выделение протопластов из клеточных стенок,

3. отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

Способы культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования.

В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г.

Во втором - суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45^оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28^оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения.

Применение изолированных протопластов:

1. Изучение химии и структуры клеточной стенки (и при разрушении, и при синтезе «denovo»).

2. Изучение свойств плазмалеммы, трансмембранных перемещений.

3. «Мягкое» выделение органелл.

4. Наблюдение за закономерностями дифференцировки клеток при слиянии протопластов, отслеживание взаимодействия ядра и цитоплазмы в полученной гибридной клетке, изучение соматических гибридов.

5. Введение чужих органелл.

6. Введение чужеродных генов в растительную клетку (трансгенез).

Применение культур растительных клеток(в общем):

1. Получение биологически активных веществ растительного происхождения:

•традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);

•синтез новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а в некоторых случаях и направленному мутагенезу;

•культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ (реакции окисления, восстановления, гидроксилирования, метилирования, деметилирования, гликолизирования, изомеризации). В результате биотрансформации получают уникальные биологически активные продукты на основе синтетических соединений или веществ промежуточного обмена растений других видов.

2. Микроклональное размножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3. Получение безвирусных растений.

4.Эмбриокультура и оплодотворение invitro часто применяются для преодоления постгамной несовместимости или щуплости зародыша, для получения растений после отдаленной гибридизации. При этом оплодотворенная яйцеклетка вырезается из завязи с небольшой частью ткани перикарпа и помещается на питательную среду. В таких культурах можно также наблюдать стадии развития зародыша.

5.Антерные культуры – культуры пыльников и пыльцы используются для получения гаплоидов и дигаплоидов.

6. Клеточный мутагенез и селекция. Тканевые культуры могут производить регенеранты, фенотипически и генотипически отличающиеся от исходного материала. При этом в некоторых случаях можно обойтись без мутагенной обработки.

7.Криоконсервация и другие методы сохранения генофонда.

8. Иммобилизация растительных клеток.

9. Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.

10.Конструирование клеток путем введения различных клеточных органелл.

11.Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.

12. Изучение системы «хозяин – паразит» с использованием вирусов, бактерий, грибов и насекомых.