2 Морфологія та цитологія бактерій роду Saccharomyces

Дріжджі Saccharomyces ‒ життєва форма грибів округлої або овальної форми (ДИВ. ДОДАТОК Б). Розмір клітин: довжина 2,5-10 мкм, діаметр 2,5-6,8 мкм. Така велика поверхня визначає активний обмін дріжджів з довкіллям. Відносна щільність кліток складає 1,055–1.06.

Рисунок 2.1 – Схема поперечного розрізу дріжджової клітки

1 – апарат Гольджі; 2 – рубець відбрунькованої клітки; 3 – ендоплазматична сітка; 4 – гранули волютину (метахроматина); 5 – вакуоль; 6 – рибосоми; 7 – жирові краплі; 8 – цитоплазматична мембрана; 9 – мале ядро; 10 – мітохондрії; 11 – оболонка клітки; 12 – цитоплазма; 13 – ядро.

Дріжджова клітина складається з клітинної мембрани, цитоплазми, усередині якої розташовані органоїди (ядро мітохондрії, рибосоми, вакуоль, Гольджі апарат) і включення (запасні речовини) у вигляді крапельок жиру, зерен глікогену і волютину. Деякі дріжджі містять пігменти. Окрім ядра в клітинах дріжджів добре помітні включення: глікогену (речовини типу крохмалю), краплинки жиру, а у вакуолях накопичується волютин. У дріжджовій клітині можна виявити оболонку, цитоплазму, ядро (після фарбування) і вакуолі. Застосовуючи різноманітні способи вітального фарбування, в клітині можна розрізнити волютин (мета хроматин), глікоген, краплини жиру.

Форма і розміри помітно змінюються у міру зростання дріжджів, в них з’являються зернистість, вакуоль збільшується (водний розчин органічних і мінеральних речовин), істотні відмінності спостерігаються в ультраструктурній поведінці окремих органел в залежності від віку клітини, зовнішніх умов, стадії онтогенезу.

Молоді дріжджі (12 годин культивування) інтенсивно розмножуються (70 – 80 % клітин, що брунькуються). У них тонка оболонка, гомогенна (однорідна) цитоплазма, вакуолі і запасні речовини відсутні.

У зрілих дріжджів (24 – 48 годин культивування) в цитоплазмі з’являється зернистість, вакуолі збільшуються, процес розмноження уповільнюється (5 – 10 % клітин, що брунькуються), з’являються мертві клітини. Ознака зрілості дріжджів ‒ наявність глікогену і мета хроматину, які відкладаються в клітині як резервний матеріал і витрачається у міру її старіння.Зрілі дріжджі під час перероблення крохмалистої сировини мають містити не більш як 1 % мертвих клітин, меляси ‒ не більше 5 %. У засівних дріжджах пивоварного виробництва допускається до 5 % мертвих клітин. Дріжджі з високою бродильною активність містять не менш як 60 – 70 % клітин з глікогеном.

Старі дріжджі (72 години і більше) мають потовщену оболонку, яку добре видно під час мікроскопування. Цитоплазма гетерогенна (зерниста), вакуолі великі, іноді в клітині їх декілька. Глікоген і метахроматин відсутні. Культура містить значну кількість клітин із жировими включеннями, клітини не розмножуються, велика кількость мертвих клітин. При відмиранні дріжджів цитоплазма скупчується в грудочку, в центрі клітина поступово деформується, оболонка розпадається, і клітина гине.

3 Генетика мікроорганізмів роду Saccharomyces

Sacch. Cerevisiae: генетичний апарат складається з 16 хромосом. Геном з 14 млн нуклеотидних пар основ і 6275 генів, хоча вважається, що лише близько 5800 з них є дійсними функціональними генами. Містить в основному унікальні послідовності і до 5 % повторювані. Наявна мітохондріальна ДНК (кільцеві молекули 25 мкм, 20 – 70 копій).Дріжджі розділяють близько 23 % свого геному з геномом людини. Геном Saccharomyces cerevisiae був першим повністю секвенованим еукаріотичним геномом. База даних геномів дріжджів дуже добре анотована і залишається важливим інструментом дослідження функції і організації генетики і фізіології еукаріотів.

Генетична база даних Saccharomyces cerevisiae підтримується Мюнхенським інформаційним ценром послідовностей білків.

В геномі дріжджів наявні транспозони («стрибаючі гени») ‒ ділянки ДНК організмів, що здатні до пересування (транспозиції) та розмноження в межах геному і є прикладами мобільних генетичних елементів (4–20 копій). Деякі штами транспозонів не містять. А в лабораторіях отримані варіанти, що містять 35 копій транспозонів.

Рід Saccharomyces об’єднує як вільноіснуючі види природної мікофлори, так і «культурні» (або виробничі), існування яких тісно пов'язано з бродильною промисловістю.

Методи культивування дріжджів (рекомбінантних ДНК):

І. Селекція (Мутагенез) та ступінчастий добір. Розсів на поживних середовищах (ПС) і відбір клонів для отримання нових продуктів.

Селекцію здійснюють на різних середовищах з різним складом — регуляція експресією (виділенням) необхідних ферментів. Якщо дріжджі посіяти на середовище з фосфатами, то індукується синтез кислої фосфатази за рахунок позитивної регуляції на продукт.

1. Комплементація (доповнення генів) з мутантними генами E.coli. Гени дріжджів при цьому вбудовуються у вектор фагу « λ » або pBR 322 і клонується в E.coli.

При цьому трансформант набуває здатності до росту на певних середовищах. Особливість: в якості об’єкту трансформації використовують мутантні клітини E.coli з мутаціями в регуляторних ділянках, що призводить до збільшення продуктивності;

2. Комплементація в якості реципієнту ауксотрофних температурочутливих або радіочутливих генів Sacch. cerevisiae. Трансформація клітин дріжджів здійснюється як дріжджовими генами, так і генами інших еукаріот;

3. Метод прогулянки хромосомою.

Дефекти несумісності генів ‒ їх перекривання. Фрагментом хромосоми з будь-яким раніше клонованим геном відбирають з дріжджових ДНК фрагменти, що частково перекриваються з ним. Визначають ці фрагменти. Вони в свою чергу використовуються для відбору з банку наступних фрагментів, що вже перекриваються з іншими. Здійснюється пошук необхідних генів та визначення їх функції.

4. Гомологія з клонованими генами інших еукаріотів і дріжджів.

В генотипах еукаріотів частина послідовності ДНК дуже схожа з послідовністю ДНК дріжджів. Вважається що це пов’язано з законами еволюції і ці послідовнсоті є одними з найдавніших в геномах. Тому такі послідовності можна використовувати для створення плазмідних конструкцій, які можна вбудовувати в дріжджі і вони будуть мітити гени інших еукаріотів.

Крім того цей метод застосовується для наукових досліджень — встановлює функції даного гену та особливості експресії і впливу на фенотип.

5. Посилення експресії (вираження) гену при клонуванні у плазмідах.

Тобто плазміди містять ген дикого типу без змін і створюються умови. В тому числі обираються плазміди такого типу, щоб було не менше 30 копій в клітині.

Трансформовані клони дріжджів інкубують в середовищі, що містить інгібітор в певній концентрації. При цьому виживають клітини з великою кількістю плазмід. Їх відбирають і використовують в якості продуцента, але постійно перевіряють.

6.Застосування евікції. Це спосіб клонування мутантних алелей з метою встановлення отриманої мутації та механізму її утворення.

З дріжджової клітини, що є вже трансформованою, виділяють хромосому (плазміду), обробляють певною рестриктазою, щоб був лише один сайт розрізання. Отримують або лінійну плазміду, або плазміду з прилеглою хромосомною ділянкою (якщо плазміда була інтегрованою). Потім проводять лігування («лигирование» синтез довгих пептидних або білкових ланцюгів) і отриманими послідовностями трансформують бактерії. Вже в бактеріях шукають (досліджують) мутантні алелі.

ІІ. Генетичного конструювання. Дріжджі, як об’єкт для генної інженерії, мають ряд переваг:

– відбувається процесінг білків (глікозилювання);

– відсутність екзопротеаз дріжджів (екзоферменти без дисульфідних зв’язків).

Використовують системи:

– протопласт – у суміші з поліетиленгліколем (ПЕГ) і ДНК (плазмідна). Дріжджова клітина обробляється глюкоїнідазою або екстрактом шлункового соку виноградного равлика. Клітинна стінка руйнується. Додається ПЕГ, плазміди і відбувається трансформація.

В рідкому середовищі клітинна стінка не регенерується. Отримані протопласти змішують з агаризованим середовищем, виливається в чашки Петрі, де клітини відновлюються. Для адсорбції екзогенної ДНК необхідно ПЕГ та катіони Са. Частота трансформації 10^-7 на протопласт. Отримані протопласти стабільні, маркер не втрачається.

Недолік: утворення не тільки диплоїдів, а й поліплоїдів; складність маніпуляції в товщині агару. Процес триває 3 години.

– клітини обробляють розчинами солей лужних металів (К, Li, Na, Ru). Клітини стають здатними до поглинання екзо-ДНК без руйнування клітинної стінки. Наявність ПЕГ як індуктора, обов'язкова. Тривалість 2 години;

– за допомогою електропорації, коли клітинна стінка обробляється струмом, що сприяє проникненню екзо-ДНК. Тривалість – 10хв. Клітинна стінка не руйнується;

– ДНК – гармата – вольфрамові, платинові або золоті (діаметр – 0,5–0,65 мкм, швидкість–500 м/с) кульки. Можна одночасно адсорбувати 2 різні плазміди.

ІІІ. Гібридизація ‒ схрещування різних рас дріжджів, що мають різні необхідні властивості з отриманням гібриду, що може мати властивості цих двох рас. Негативні фактори: випадковість і невелика ефективність.

Схрещування Sacch. cerevisiae штаму, що використовується для пивоваріння з низькопродуктивним штамом, але здатним до зброджування рафінози. Отримують диплоїдні гібриди, що зброджують рафінозу на 70 % від вмісту ПС.

Для генетичних досліджень важливий короткий життєвий цикл дріжджів і можливість швидкого і легкого отримання великої кількості їх особин і поколінь, що дозволяє вивчати навіть дуже рідкісні явища.