3.14. Генная инженерия

На основании достижений молекулярной биологии, био­химии и генетики в последние десятилетия интенсивно раз­вивается новое направление — генная инженерия, целью кото­рой является конструирование генетических структур по заранее намеченному плану, создание организмов с новой ге­нетической программой путем переноса генетической ин­формации из одного организма в другой.

Методы генной инженерии были разработаны в 60-70-х годах прошлого столетия. Они включают следующие основ­ные этапы:

▪ получение генетического материала;

▪ включение этого материала в автономно реплицирую­щуюся генетическую структуру (векторную молекулу) и со­здание рекомбинантной ДНК;

▪ введение рекомбинантных молекул ДНК в клетку-реци­пиент и включение ее в хромосомный аппарат;

▪ отбор трансформированных клеток, в геном которых вклю­чен переносимый ген.

В настоящее время применяют несколько способов полу­чения генов для пересадки. Если полностью расшифрована последовательность нуклеотидов, то ген может быть синте­зирован химическим путем. Впервые искусствен­ный ген аланиновой т-РНК, состоящий из 77 пар нуклеоти­дов, был синтезирован индийским ученым Г. Корана (1970). В 1976 г. был синтезирован ген тирозиновой т-РНК, состоя­щий из структурной и регуляторной частей (промотор и терми­натор), который при введении в бактериальную клетку нор­мально функционировал. Однако химическим способом удает­ся синтезировать только небольшие по размеру гены прокариот.

Синтез сложных генов осуществляют с помощью процес­сов обратной транскрипции, в основе которых лежит метод ферментативного синтеза. Выделяют и-РНК, и на ней, как на матрице, с помощью фермента ревертазы синте­зируют комплементарную ей нить ДНК, которую затем реп­лицируют (фермент ДНК-полимераза). Гены, синтезирован­ные с помощью ревертазы, не имеют регуляторной части и промотора и вследствие этого не могут функционировать в животных клетках. При переносе в бактерию к структурным генам присоединяют промотор микробной клетки, после чего транскриптон начинает работать.

Выделять необходимые для пересадки гены можно с помощью ферментов рестриктаз. В 1974 г. были от­крыты ферменты рестриктазы, способные узнавать опреде­ленные последовательности нуклеотидов и делать симмет­ричные, расположенные наискось друг от друга разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра узнавания. В ре­зультате на концах каждого фрагмента расщепленной ДНК образуются короткие одноцепочечные участки, называемые "липкими концами" (рис. 3.21).

Рис. 3.21. Схема действия ре­стриктаз

К настоящему времени выделено свыше 200 различных рестриктаз, разрывающих молекулы ДНК с разной последовательностью нук­леотидов. Используя различные рестриктазы, удается выделять необходимые для пересадки гены.

Полученные различными спо­собами гены соединяются с вектор­ными молекулами, которыми могут служить плазмиды бактерий, липосомы, фаги и вирусы. Фаги и виру­сы передают генетическую инфор­мацию посредством трансдукции. Кольцевая молекула ДНК плазмиды разрывается той же рестриктазой, что и выделяемый ген. В области разрыва образуются "липкие концы", комплемен­тарные "липким концам" пересаживаемого гена. Фермент лигаза сшивает "липкие концы" гена и плазмиды. Получается рекомби-нантная молекула ДНК, которая обладает способностью прони­кать в клетку-реципиент. Комбинируя различные рестриктазы и лигазы, можно разрезать нить ДНК в разных местах и получать рекомбинантные молекулы (рис. 3.22).

Рис. 3.22. Схема встраивания гена в плазмиду и введения

рекомбинант­ной плазмиды в бактерию

Так как рекомбинированные молекулы ДНК попадают не во все клетки, то с помощью специальных методов (чаще все­го на селективных питательных средах) осуществляют отбор трансформированных клеток (с перенесенным геном). В дальнейшем проводят клонирование — размножение клеток с рекомбинантной ДНК — и получают клон клеток с заданны­ми свойствами.

Объединение чужеродных генов в одной клетке чревато опас­ными последствиями. Плазмиды способны соединяться в любых комбинациях независимо от видовых и иммунологических барь­еров. Конструирование новых разновидностей болезнетворных бактерий, устойчивых к лекарственным препаратам, может при­вести к возникновению серьезных эпидемий. В 1973 г. была про­ведена первая международная конференция по предупреждению опасных последствий генной инженерии. Опыты на время были запрещены. В 1975 г. Р. Кертис получил мутант кишечной палоч­ки, нежизнеспособный в естественных условиях в связи с нару­шением синтеза оболочки. Безопасная для человека и животных бактерия может жить только в лабораторных условиях. Это поз­волило возобновить опыты по генной инженерии. Такие иссле­дования проводятся в специальных строго изолированных лабо­раториях с обязательным соблюдением определенных мер безо­пасности.

Дальнейшее развитие генной инженерии базируется на следующих достижениях молекулярной биологии:

▪ возможность вызывать с помощью химических мутагенов специфичес-

кие мутации в определенных генных локусах;

▪ возможность передавать генетическую информацию у эукариот неполо-

вым путем (трансформация или трансдукция), что позволит проводить генную терапию соматических заболеваний;

▪ возможность заменять дефектные гены, используя в качестве перенос-

чиков вирусы, липосомы и др.;

▪ возможность включать в геном человека искусственно син­тезированные гены.

Генная инженерия — интенсивно развивающееся и пер­спективное направление генетики. Методами генной инже­нерии в промышленных масштабах уже получены клоны клеток кишечной палочки, способные продуцировать соматотропин, инсулин, интерферон и др. Обычно эти препараты получают из соответствующих тканей животных. Преимуще­ство препаратов, полученных методами генной инженерии, заключается в возможности их синтеза в достаточных количе­ствах, в биохимической чистоте и абсолютной стерильности.

Уже созданы растения, способные усваивать атмосферный азот, микроорганизмы, разрушающие углеводороды нефти и синтезирующие из них пищевые белки. Разработаны методы внесения генов патогенных вирусов в бактериальные клетки и приготовления из синтезированных ими белков противовирус­ных сывороток; проходят клинические испытания методы лече­ния некоторых опухолей (например, рака молочной железы), иммунодефицитных состояний и энзимопатий. В будущем генная инженерия поможет человечеству избавиться от ряда наследст­венных заболеваний путем пересадки зародышу недостающих ге­нов или замены мутантных генов.

В настоящее время создаются банки генов человека, некото­рых животных и растений.

Подробнее рассмотрим перспективы генной те­рапии человека. К концу 2001 г. в мире было утвержде­но свыше 400 генно-терапевтических проектов клинических испытаний методов лечения многих заболеваний человека.

Необходимо различать две разные цели генной терапии — коррекцию генетических дефектов в соматических клетках и коррекцию в зародышевых клетках или на самых ранних ста­диях развития зиготы.

В настоящее время для переноса генов можно использо­вать клетки костного мозга, фибробласты и зародышевые клетки человека. Эти клетки можно извлечь из организма, культивировать, перенести в них нужный ген и снова ввести пациенту, в организме которого они будут размножаться. Наи­более перспективным является перенос нужных генов, связанный с использованием ретровирусов. Для того чтобы при­менять на практике генную инженерию, необходимо быть уверенным в ее безопасности. Например, человеческие про-тоонкогены по структуре отчасти сходны с нуклеиновой кис­лотой ретровирусов и при заражении ими клеток возможна модификация протоонкогенов и превращение их в онкогены.

В экспериментах на мышах проведена генная терапия на уровне зародышевых клеток: в оплодотворенные яйцеклетки мышей карликовой линии вводили гены гормона роста крыс. При этом только часть потомков (6 из 41) достигли ги­гантских размеров. Очевидно, что большинство введенных генов не подвергались нормальной регуляции, так как не удавалось внедрять их в места обычной локализации в хро­мосоме. Встраивание происходило в случайном порядке и в некоторых случаях это вызывало у мышей-реципиентов серьезные нарушения работы нормальных генов или их му­тации в участках встраивания. По мнению большинства ме­дицинских генетиков, метод генной терапии не следует в обозримом будущем применять к оплодотворенным клеткам человека, так как опасность изменения его генетической конституции слишком велика. По рекомендациям Всемир­ной организации здравоохранения ЮНЕСКО и Совета Ев­ропы временно приостановлено проведение экспериментов и клинических испытаний по трансгенозу зародышевых кле­ток человека.