1. Сучасні методи діагностики сказу
Діагноз на сказ встановлюють на підставі комплексу епізоотичних, клінічних, патологоанатомічних і лабораторних досліджень.
Для проведення дослідження на сказ в лабораторію направляють свіжі трупи дрібних тварин або голови, від великих тварин – відібраний головний мозок.
Патологічний матеріал доставляють в лабораторію з супровідним документом, що містить такі дані: назва та адреса відправника, вид тварини, прізвище та адреса власника тварини, прізвище та адреса людини, яка була в контакті, інформацію про вакцинацію тварини, анамнестичні та клініко-епізоотологічні дані.
Відбирають проби головного мозку одним із методів: метод розтину черепної коробки, метод поздовжнього розпилювання голови або без розтину черепної коробки.
Найчастіше застосовують метод відбирання зразків мозку розтинанням черепної коробки з наступним відбиранням мозку.
Проби відбирають з наступних ділянок головного мозку: кори великих півкуль, мозочку, довгастого мозку та амонового рогу.
В польових умовах при відбиранні великої кількості зразків від диких тварин, рекомендовано використовувати один з методів відбирання зразків без розтину черепа: відбір через потиличний отвір або ретроорбітальним методом.
Під час транспортування матеріалу для діагностики сказу (голови тварин або зразків мозку) унеможливлюють ризик контамінації людей: мозок уміщують в вологонепроникний контейнер; голови тварин загортають в адсорбувальний матеріал, заклеюють в пластиковий пакет і опечатують, після чого поміщають в контейнер з охолоджувачем.
У разі неможливості доставити матеріал в лабораторію протягом доби, біоматеріал консервують в 30-50-відсотковому розчині гліцерину на фосфатному буфері.
Відібрані проби головного мозку зберігають за температури мінус 20 0С до завершення всіх необхідних досліджень. Після закінчення досліджень і виписування результатів весь матеріал знешкоджують автоклавуванням протягом 30 хвилин в режимі тиску 1,5 атмосфери.
Роботи з матеріалом, підозрілим в зараженні на сказ, проводять тільки в тих лабораторіях, які мають дозвіл територіальних режимних комісій на роботу із збудниками 2-4 групи патогенності. До роботи допускають тільки підготовлений персонал після отримання відповідного допуску. Весь персонал, який працює з матеріалом підозрілим в зараженні на сказ, повинен бути вакцинований не рідше 1 разу на рік за рахунок роботодавця. Особам, не щепленим проти сказу, доступ в приміщення, де проводяться роботи з матеріалом, заборонений. Люди, які працюють в лабораторіях з діагностики сказу, ризикують бути зараженими в результаті випадкового інфікування слизових оболонок під час роботи з патологічним матеріалом, або під час контакту з аерозолями, які утворюються в процесі приготування суспензії та зараженні тварин при постановці біологічної проби. Тому всі маніпуляції з матеріалом, підозрілим на зараження сказом, необхідно проводити таким чином, щоб унеможливити утворення аерозолів. Особливу увагу необхідно звернути на роботу із скельцями для мазків-відбитків.
Розтин трупа, виймання мозку та інші роботи з патологічним матеріалом проводять в умовах суворого дотримання заходів особистої безпеки: голову тварини міцно фіксують, руки захищають двома парами рукавичок – хірургічними й анатомічними, очі – окулярами, ніс і рот – 6-шаровою марлевою пов’язкою. Для цієї роботи використовують протичумний костюм 1 типу.
Лабораторні дослідження матеріалу на сказ проводять позачергово та безкоштовно. Про результати дослідження (проміжні та заключні) негайно повідомляють установу ветеринарної медицини або спеціаліста, який направив матеріал, а також головного лікаря ветеринарної медицини району (міста), які в свою чергу повідомляють відповідні державні заклади охорони здоров'я.
Діагноз на сказ вважається встановленим у разі отримання позитивних результатів хоча б одним із методів:
- ідентифікації антигену вірусу сказу методом флуоресціюючих антитіл (МФА),
- виділення вірусу біопробою на білих мишах,
- ізоляції вірусу сказу за допомогою перещеплювальної лінії культури клітин з наступною ідентифікацією МФА.
При дослідженні матеріалів від тварин, які не мали контакту з людиною (діагностичний відстріл, знайдені трупи диких та безпритульних тварин), діагноз встановлюють за результатами ідентифікації антигену вірусу сказу методом флуоресціюючих антитіл (МФА).
1.1. Метод флуоресціюючих антитіл (МФА). З усіх серологічних методів МФА отримав широке поширення. Основні його достоїнства полягають у високій чутливості (90 +99%), специфічності, простоті постановки та можливості отримання результатів протягом декількох годин. За точністю він зіставимо з біопроб, але перевершує її за рахунок виявлення антигену вірусу з низьким титром і вірулентністю в досліджуваному матеріалі. Суть методу полягає в з'єднанні мічених антитіл зі специфічним антигеном і спостереженні світних комплексів антиген-антитіло під люмінесцентним мікроскопом. Найбільш широке поширення отримав прямий метод, коли мічені ФИТЦ антирабічні антитіла наносять безпосередньо на мазки-відбитки, зрізи мозку, моношар клітин. Непридатні для дослідження проби мозку, консервовані спиртом, формаліном та іншими засобами, що викликають денатурацію і руйнування антигену вірусу.
Фіксують препарат ацетоном. При дослідженні під люмінесцентним мікроскопом антиген вірусу сказу має вигляд яскравих жовто-зелених або зелених гранул різної форми і величини, порівнянних з тільцями Бабеша-Негрі, на темному сіро-зеленому фоні.
Діагноз вважають встановленим, якщо в кількох полях зору виявляють не менше 10 типових гранул з інтенсивністю світіння не менше ніж на два хрести (++). Остаточний діагноз може бути поставлений на 4 ... 8-у добу після інфікування мишей досліджуваним матеріалом.
У тих випадках, коли на дослідження мозок поступає загнити, з нього готують матеріал і вводять по 0,05 см3 в губу білим мишам масою тіла до 8 г: від полеглих мишей беруть мозок, готують матеріал і досліджують в МФА.
1.2. Біологічна проба. Метод біологічної проби на мишах для виділення вірусу є одним з основних при постановці діагнозу. Про чутливість мишей до вірусу сказу відомо з 1935 р Високу чутливість до збудника виявляють миші у віці 2 3 сут. Суть методу полягає у виділенні вірусу від хворих, убитих або загиблих тварин шляхом введення патологічного матеріалу білим мишам і подальшої його ідентифікацією. Результат позитивної біопроби повинен бути підтверджений за допомогою МФА. Незважаючи на те що цей метод застосовують широко і він є високочутливим, він не позбавлений деяких недоліків. Крім необхідності використання більшого числа мишей потрібен тривалий час для отримання результатів: інкубаційний період при зараженні вуличним вірусом сказу коливається від 7 до 25 діб, а для деяких ізолятів до 2 міс. Це, в свою чергу, впливає на час отримання відповіді про наявність або відсутність захворювання. Однак незважаючи на ці недоліки, метод біопроби залишається самим обов'язковим і чутливим при дослідженні патматеріалу при постановці діагнозу.
1.3. Виділення та ідентифікація вірусу в культурі клітин. Виділення вірусу проводять в різних культурах клітин: нирки хом'яка (ВНК-21), мишачої нейробластоми (С-1300) клон NNA і фібросаркоми собаки (А-72). Дослідження показали високу чутливість ВНК-21, яка дозволяє протягом 24‑48 год виділити і провести титрування вуличних штамів вірусу сказу. Відомо, що клітини мишачої нейробластоми (С-1300) найбільш чутливі до зараження і не потребують адаптації вуличного вірусу в порівнянні з іншими клітинами.
Виявлення антигену вірусу сказу проводять в МФА. Виділення вірусу в культурі клітин значно скорочує час для виявлення збудника і постановки діагнозу від 21‑25 до 2 сут і виключають досліди на експериментальних тварин. Однак цей метод, на жаль, не може застосовуватися в кожній лабораторії через відсутність в них культури клітин і навичок роботи з ними. Тому внутрішньомозкове зараження мишей залишається надійним і достовірним методом лабораторної діагностики.
1.4. Виявлення генома вірусу. При діагностиці сказу використовують полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Вона є найбільш чутливим методом при дослідженні матеріалу з низьким титром вірусу, і це дає перевагу в діагностиці на ранній стадії хвороби. За допомогою ПЛР можна диференціювати штами вірусу сказу.
Сутність цього методу полягає у виявленні РНК вірусу; діагноз може бути поставлений протягом 5-24 год. Для ПЛР зазвичай використовують праймери, специфічно ампліфікують гени нуклеопротеіна та інші G-гени вірусу. Для дослідження беруть слину, слинну залозу, спинномозкову рідину, головний мозок.
Гістологічний
метод.
Заснований на виявленні в клітинах
нервової тканини специфічних
цитоплазматичних тілець-включень
Бабеша-Негрі. Цей метод служить допоміжним,
оскільки не у всіх тварин він дозволяє
виявити тільця. За оцінкою різних
дослідників, тільця Бабеша-Негрі не
вдається виявити в 10 50% випадків
захворювання по ряду об'єктивних причин:
тривалість перебігу хвороби, властивості
збудника, своєчасне взяття матеріалу
для дослідження, правильність його
зберігання та доставка в лабораторію.
Рис. 1. Тільця Бабеша-Негрі у гістологічному зрізі |
Позитивним результатом вважають, коли виявляють чітко окреслені овальні або довгасті гранулярні освіти діаметром 2‑10 мкм (тільця Бабеша-Негрі) рожево-червоного або іншого, залежно від барвника, кольору, розташовані в нейронах. При перегляді нерідко знаходять сформовані бичка поза клітин; їх також треба враховувати при постановці діагнозу. Для диференціювання тілець Бабеша-Негрі від інших внутрішньоклітинних включень, що зустрічаються при чумі м'ясоїдних і інфекційному гепатиті, застосовують звичайну забарвлення препаратів гематоксилін-еозином.