7.4. Анализ крови и печени

Гематологические методы рассчитаны на работу с небольшими количествами крови, кровяной плазмы, сыворотки. Гематологические по­казатели могут быстро изменяться в процессе отлова рыбы, ее транс­портировка, взятия крови и т.д.

Стрессовые и асфиксические явления приводят к накоплению в организме углекислота, молочной кислоты, глюкозы в крови, кортикоидных гормонов и адреналина, выбросу в кровь запасных эритроцитов, сопровождаемому повышением концентрации гемоглобина, разбуханию эритроцитов, гемолизу и изменению солевого состава плазмы крови. При быстро наступившем дефиците кислорода концентрация гемоглобина снижается. Поэтому желательно брать кровь у голодной рыбы, выдержанной в хорошо аэрированной воде в течение 5-10 мин. после отлова. Если это невозможно, то пойманную рыбу следует сразу помещать в ведро с водой из водоема в соотношении 1:10, содержащей релаксирующую концентрацию одного из анестетиков: пропоксат (0,6-0,8 мг/л), хинальдин (25-30 мг/л), серный эфир (1-1,5%). Вода, в которой нахо­дится анестезированная рыба, должна постоянно аэрироваться.

Могут быть проведены следующие гематологические анализы:

• определение гематокрита (объема клеточных элементов в крови),

• оценка степени гемолиза (распада кровяных телец),

• определение общего количества сывороточных белков,

• определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ)

• оценка осморезистентности эритроцитов (ОРЭ),

• определение количества гемоглобина в крови.

Техника взятия крови. Кровь можно брать несколькими способами: из сердца, жаберной вены, подкожной артерии, путем отсечения хвостового стебля (каудоэктомия).

Это зависит от размера объекта, необходимого количества крови, оснащенности и навыка. Для этой цели чаще используют шприц с инъекционной иглой либо пастеровскую пипетку. Инструменты предварительно обрабатывают водными растворами антикоагулянтов: цитрата или оксалата натрия в концентрации 2 мг/мл, лучше гепарин - 1000 ед./мл или 8 мг/мл, 1 ед. сухого гепарина = 0,0077 мг. Например, выпускаемый в продажу раствор гепарина с исходной концентрацией 5000 м.е./мл разводят в 5 раз. Перед взятием крови прибегают также к ополаскиванию шприца и иглы прокипяченным 0,65% раствором NаСl. При любом способе взятия крови необходимо соблюдать определенные предосторожности: место пункции после снятия чешуи обрабатывают 70^о спиртом и высушивают ватным тампоном для удаления слизи, богатой тромбокиназой. Место взятия крови нельзя сжимать во избежание попадания тканевой жидкости, искажающей результаты.

Повторно брать кровь из одного и того же места не рекомендуется. Анализируемая кровь должна быть свежевыпущенной, жидкой. Во избежание разрушения эритроцитов (гемолиза) кровь выпускают в подготов­ленные пробирки (или часовое отекло) осторожно по стенке.

Способы взятия крови.

Из сердца. Рыбу при помощи салфетки надежно фиксируют спиной вниз и вводят иглу (конец пастеровской пипетки), предвари­тельно проколов кожу препаровальной иглой, в точку: у форели - в се­редине линии, соединяющей основание грудных плавников, у карпа - несколько ближе к голове.

Иглу (пипетку) вводят под углом 30° относительно фронтальной плос-кости рыбы. При удачном попадании кровь поступает сразу же.

Из хвостовой вены. Рыбу фиксируют так же. Иглу (пипетку) вводят с брюшной стороны в точку за анальным плавником под углом 45° до упора в позвоночник. Легким движением вправо и влево прокаливают вену и набирают кровь путем осторожного подсасывания (при удачном попадании кровь сразу же появляется в капилляре).

Из подкожной артерии. Рыбу фиксируют на боку. Точка введения: у сеголетков приблизительно на 1-1,5 мм ниже пересе­чения боковой линии и перпендикулярной к ней, мысленно опущенной от анального отверстия. У более крупных рыб - в точке пересечения от задней границы анального плавника.

Путем отсечения хвостового стебля. Это наиболее простой способ. Отсечению предшествует тщательная об­работка поверхности. Хвостовой стебель отрезается за анальным плав­ником острым скальпелем, ножом или ножницами во избежание размозжения тканей. Кровь собирают, держа рыбу головой вверх. Данный способ не исключает попадания в кровь тканей жидкости, вследствие чего результаты могут оказаться недостоверными. Учитывая это, для исследования берут 2-3-ю каплю.

Получение сыворотки крови. Взятую кровь переливают в чистые су­хие пробирки. Когда кровь свернется, отделяют сгусток от стенок пробирки путем обводки тонкой упругой проволочкой, конец которой погружен до дна. После этого для быстрого получения сыворотки кровь центрифугируют сразу же в течение 5 мин при 3 тыс.об./мин.

Сыворотку можно отделить и на следующий день в пробирках, оставленных в холодильнике при +4°С (при более долгом хранении насту­пает гемолиз). У карпа в норме сыворотка бесцветная или слабо желтоватая. Сыворотку отсасывают в чистые пробирки, которые можно хранить долгое время в морозильной камере холодильника. Закрывать пробирку удобно путем заклеивания квадратным кусочком лейкопластыря. Повторные замораживания и отстаивания сывороток не рекомендуются. В полевых условиях, где нет холодильника, для кратковременного хранения и доставки проб удобно пользоваться широкогорлым термосом со льдом.

Определение гематокрита. В организме может наблюдаться физиологическое или патологическое обезвоживание (сгущение) крови или, наоборот, ее разжижение. В обоих случаях в единице объема крови, соответственно, увеличивается или уменьшается содержание форменных элементов.

Оборудование и реактивы. Для гематокрита можно использовать либо специальную микрогематокритную центрифигу «МГЦ-8», либо микроцентри-фугу Шкляра, либо микрогематокритную насадку к лабораторной центрифуге «ЦУМ-1». Последняя представляет собой градуированный капилляр диаметром 1 мм, разделенный на 100 частей, монтируемый в металлическую оправу, насаживаемую на ось центрифуги.

Для обработки капилляров при определении гематокрита на центрифуге «МГЦ-8» применяется либо гепарин - 1000 ед./мл, либо раствор Геллера и Пауля: 1,2% оксалат аммония в смеси с оксалатом калия -0,8%. Трубочку предварительно следует прополоскать несколько раз раствором гепарина и высушить при комнатной температуре. Раствор Геллера и Пауля насасывают в трубочку и высушивают в сушильном шкафу при 60°С. Использование высушенного антикоагулянта имеет то преимущество перед жидким, что устраняет вычисления, связанные с разведением крови.

Ход определения. Гематокритная величина, или гематокрит выражает долю объема крови (%), занимаемую форменными элементами, и определяется центрифугированием крови сразу же после ее взятия в гематокритных трубочках или капиллярах, обработанных антикоагулянтом. При заполнении кровью в капилляр не должны попадать пузырьки воздуха. Заполнение гематокритной трубочки удобно проводить с помощью насасывания через подключенную к ней резиновую трубку подходящей длины и диаметра со стеклянным мундштуком.

Время вращения зависит от скорости. Центрифугируют до получения постоянного объема эритроцитов. Ориентировочно на «МГЦ-8» при 9000 об./мин, на «ЦУМ-1» при 6000 об./мин. - 5 мин. Ручку микроцентрифуги Шкляра вращают со скоростью 60-70 об./мин (насадка при этом вращается со скоростью 7000 об./мин). Кровь центрифугируют в течение 1 мин. Форменные элементы располагаются в периферических концах капилляра, а плазма - в центре. По делениям капилляра определяют соотношение между объемами плазмы и форменных элементов.

Согласно Международной системе единиц (СИ), показатель гематокрита выражается в л/л: 1 л/л - 100%. Например, по старой системе гематокритное число обозначается как 30%, по новой - 0,30 л/л.

Практические рекомендации. Если нет шприца, пастеровских пи­петок и гематокритных трубочек, то в полевых условиях проводят отбор проб, определение гематокрита, получение сыворотки и т.д. при помощи обычной инъекционной иглы и стандартной полихловиниловой трубочки от обычной шариковой (трубочка длиной 100 мм со стандартным внутренним диаметром 2 мм имеет объем 0,3 см³). Предварительно из стержня шариковой ручки с помощью пинцета вынимает лагунный пишущий элемент, служащий в дальнейшем в качестве пробки. Трубку очищают смоченными спиртом сменяемыми ватными тампончиками, обвертываемыми вокруг конца упругой проволочки диаметром около I мм. Канал пишущего элемента освобождают с помощью заостренных палочек и затем плотно закрывают тонкой конусной пробкой, вырезанной из стенки подходящей полиэтиленовой пробки (например, бутылочной). Выступавший конец срезают вровень с краями пишущего элемента. Канал можно заполнить эпоксидной смолой или пластилином. Для взятия крови любым из указанных способов на конец очищенной трубочки (лучше тот, откуда изъят пишущий элемент) одевают иглу со сточенным под углом 45° (можно на бруске) концом для лучшего попадания в кровеносный сосуд с последующей обработкой раствором антикоагулянта. Заполнить трубку кровью можно легко и без иглы, приставляя ее в наклонном положении к капле, образующейся на срезе после отсечения хвоста. После взятия крови, удерживая трубочку, как пипетку, снимают иглу и закрывают конец трубочки пробочкой, подготовленной указанным выше способом. Для определения гематокрита трубочку с кровью центрифугируют в горизонтальном положении. Для этого ее плотно вставляют в канал, перпендикулярный оси центрифуги, проделанный нагретым на пламени спиртовки (горелки) гвоздем в пробках из обычного мягкого пенопласта, вставленных предварительно в широкие гнезда ротора уг­ловой центрифуги. После центрифугирования при помощи штангенциркуля или линейки определяют расстояние от дна трубки до поверхности жидкости и от дна трубки до линии раздела осевших кровяных клеток. Отношение этих величин, выраженное в процентах, представляет собой гематокрит.

Например, высота столбика всей жидкости 14 мм, высота столбика кровяных клеток 7 мм, гематокрит = 7:14_*100 = 50%.

Полученную сыворотку можно отсосать с помощью другой чистой трубочки с иглой в пробирки, сделанные из обрезков трубочек путем заплавления их одного конца над пламенем спиртовки и последующего обжатия с помощью пинцета, либо, что удобнее, с использованием пробочек, изготовленных, как указано выше. Во избежание образования воздушной пробки конец иглы необходимо перед выпусканием крови опускатъ сразу до дна.

Указанное приспособление очень удобно для работы с малыми количествами крови, получаемыми от рыб небольшого размера и молоди, т.к. тонкий диаметр трубки обеспечивает достаточную для отбора высоту столбика сыворотки, что практически невозможно при использовании широких пробирок. При необходимости стержень можно укоро­тить.

Оценка гемолиза При различного рода заболеваниях воздействиях в крови наблюдается гемолиз - распад эритроцитов и выход из них красного пигмента гемоглобина. В этих случаях сыворотка бывает окрашенной с различной интенсивностью в цвета от слегка розоватого до красного в зависимости от степени гемолиза. Для внесения объективного признака степени гемолиза рекомендуется следующий цветной стандарт. Кровь от здоровой рыбы (содержание Нв 8-10г%) смешивают дистиллированной водой в соотношении 1:4 для получения гемолизированной жидкости, которую затем разводят в уленгутовских пробирках в соотношениях, приведенных в табл. 52.

Степень гемолиза выражают в крестах с указанием цвета по стандарту, либо в абсолютных величинах содержания гемоглобина в цветном стандарте, приготовленном из крови с содержанием Нв - 9,0 г%.

Полученную указанным выше способом сыворотку осторожно отсасывают пипеткой, помещают в уленгутовскую пробирку того же диаметра, что и пробирки в цветном стандарте. Затем просматривают столбик сыворотки в исследуемой пробирке параллельно с каждым цветным стандартом на просвет перед белым листом бумаги и устанавливают степень гемолиэа в %. Эта же сыворотка может быть использована для определения общего содержания белка.

Таблица 52

Оценка гемолиза по цветному стандарту

Показатели	Пробирки
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Количество гемо лизированной жидкости, мл	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9
Количество воды, мл	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1
Содержание Нв в цветном стандарте, г%	0,18	0,36	0,54	0,72	0,90	1,08	1,26	1,44	1,62
Цвет	светло-розовый			розовый	Розово-красный		красный
Степень гемолиза	Слабый			явственный	Сильный		Очень сильный

Содержание общего белка в крови рыб (рефрактометрический метод). Содержание белка в сыворотке крови менее 2% - показатель неудовлетворительного состояния организма. Уменьшение его отмечается в ответ на воздействие низких температур и некоторых токсинов. Однако низкие значения содержания белка в крови могут быть и при нормальном ходе физиологических процессов, например, у особей в посленерестовый период (табл.53).

Оборудование и реактивы: рефрактометр, бумага фильтровальная, вата, палочка стеклянная, смесь спирта и эфира для обезжиривания (1:1).

Ход определения. Раскрывают камеру с призмами, ополаскивают их водой, промокают фильтровальной бумагой, ватой и протирают спиртоэфирной смесью. Показатель преломления дистиллированной воды на рефрактометре при 20^о равен 1,333. Это значит, что прибор установлен и работает правильно. Сыворотку крови получают, так описано выше.

Наносят на призму каплю исследуемой сыворотки, закрывают камеру и делают отсчет. Настройку прибора сбивают и определение повторяют дважды. Используют среднюю величину отсчета, до которой определяют содержание белка, пользуясь табл.12. Если температура от­личается от 20⁰С, то вводят поправку – 0,0001 на каждый градус (поправку вычитают при более низкой температуре и прибавляют при более высокой). Результаты могут быть искажены за счет веществ сыворотки с высоким показателем преломления. Например, липидов или за счет гемолиза.

При наличии гемолиза необходимо из результата определения общего содержания белка вычесть экспериментально установленную поправку на степень гемолиза: при «+» - 0,6-0,7; при «++» - 1,2-1,4; сильно гемолизированная сыворотка для определения общего содержания белка использована быть не может.

Таблица 53