3. Терминация

Терминация трансляции наступает в том случае, когда в А-центр рибосомы попадает один из стоп-кодонов: UAG, UAA или UGA. Для стоп-кодонов нет соответствующих тРНК. Вместо этого к рибосоме присоединяются 2 белковых высвобождающих фактора RF (от англ, releasingfactor) или фактора терминации. Один из них с помощью пептидилтрансферазного центра катализирует гидролитическое отщепление синтезированного пептида от тРНК. Другой за счёт энергии гидролиза ГТФ вызывает диссоциацию рибосомы на субъединицы (рис. 4-41).

Интересно отметить, что факторы трансляции, реализующие эффекты за счёт гидролиза ГТФ, являются членами суперсемейства G-белков, в которое входят G-белки, участвующие в трансдукции сигналов гормонов и других биологически активных веществ, и Ras-белки, функционирующие как факторы роста (см. разделы 11, 15). Все G-белки связывают и гидролизуют ГТФ. Когда они связаны с ГТФ, то активны и участвуют в соответствующих метаболических процессах, а когда в активном центре в результате гидролиза ГТФ превращается в ГДФ, эти белки приобретают неактивную конформацию.

Таким образом, матричная природа процесса трансляции проявляется в том, что последовательность поступления аминоацил-тРНК в рибосому для синтеза белка строго детерминирована мРНК, т.е. порядок расположения кодонов вдоль цепи мРНК однозначно задаёт структуру синтезируемого белка. Рибосома сканирует цепь мРНК в виде триплетов и последовательно отбирает из окружающей среды "нужные" аа-тРНК, освобождая в ходе элонгации деацилированные тРНК.

Малая и большая субъединицы рибосомы в процессе трансляции выполняют разные функции: малая субъединица присоединяет мРНК и декодирует информацию с помощью тРНК и механизма транслокации, а большая субъединица ответственна за образование пептидных связей.

43. Посттрансляционная модификация полипептидных цепей

Полипептидные цепи могут подвергаться структурным модификациям, либо будучи ещё связанными с рибосомами, либо после завершения синтеза. Эти конформационные и структурные изменения полипептидных цепей получили название посттрансляционных изменений. Они включают:

удаление части полипептидной цепи, ковалентное присоединение одного или нескольких низкомолекулярных лигандов, приобретение белком нативной конформации.

Многие модификации осуществляются в ЭР. Здесь происходят фолдинг полипептидных цепей и формирование уникальной третичной или четвертичной структуры белков. Причём для поддержания нативной конформации молекул огромное значение имеет правильное формирование дисульфидных связей.

Частичный протеолиз

Многие белки, секретируемые из клеток, первоначально синтезируются в

виде молекул-предшественников, функционально неактивных. Удаление части

полипептидной цепи специфическими эндопротеазами приводит к образованию

активных молекул. Некоторые белки-предшественники расщепляются в ЭР или

аппарате ; Гольджи. другие — после секреции. Так, неактивные

предшественники секретируемых ферментов — зимогены — образуют активный

фермент после расщепления по определённым участкам молекулы: зимоген

панкреатической железы трипсиноген превращается в активный трипсин после

секреции в тонкий кишечник.

Наглядным примером последовательного двухстадийного протеолиза служит

образование активных форм пептидных гормонов (например, инсулина или

глюкагона) из препрогормонов. Первоначально N-концевой сигнальный пептид

молекулы-предшественника удаляется в ЭР процессе синтеза белка и

образуется неактивный прогормон. Затем прогормон в секреторных гранулах,

формирующихся в аппарате Гольджи подвергается действию эндо- и/или

экзопротеаз и превращается в активный гормон.

Ковалентные модификации

Структурные белки и ферменты могут акгивироваться или инактивироваться в

результате присоединения различных химических групп фосфатных, ацильных, метальных, олигосахаридных и некоторых других.

Фосфорилирование белков осуществляется по гидроксильным группам серина,

треонина и, реже, тирозина ферментами из группы протеинкиназ, тогда как

дефосфорилирование катализируют гидролитические ферменты

фосфопротеинфосфатазы

Гликозилирование. Белки, входящие в состав плазматических мембран или

секретирующиеся из клеток, подвергаются гликозидированию. Углеводные

цепи присоединяются по гидроксильным группам серина или треонина

(О-гликозилирование) либо аспарагина (N-гликозилирование).

Последовательное наращивание углеводного фрагмента происходит в ЭР и

аппарате Гольджи.

Многочисленным модификациям подвергаются боковые радикалы некоторых

аминокислот: в тиреоглобулине йодируются остатки тирозина; в факторах

свёртывания крови карбоксилируются остатки глутамата; в ЭР фибробластов

гидроксилируился остатки пролина и лизина в цепях тропоколлагена.

Посттрансляционная модификация

Посттрансляционная модификация — это ковалентная химическая модификация белка после его синтеза на рибосоме. Для многих белков посттрансляционная модификация оказывается завершающим этапом биосинтеза, который является частью процесса экспрессии генов. Наряду с альтернативным сплайсингом посттрансляционные модификации увеличивают разнообразие белков в клетке.

На сегодняшний день известно более двухсот вариантов посттрансляционной модификации белков, и, по всей видимости, модификациям подвергается подавляющее большинство белков[2], более того, один и тот же белок может подвергаться нескольким различным модификациям. Посттрансляционные модификации оказывают различные эффекты на белки: регулируют продолжительность их существования в клетке, ферментативную активность, взаимодействия с другими белками. В ряде случаев посттрансляционные модификации являются обязательным этапом созревания белка, в противном случае он оказывается функционально неактивным. Например, при созревании инсулина и некоторых других гормонов необходим ограниченный протеолиз полипептидной цепи, а при созревании белков плазматической мембраны — гликозилирование.

Посттрансляционные модификации могут быть как широко распространёнными, так и редкими, вплоть до уникальных. Так гликозилирование является одной из наиболее часто встречающихся модификаций — считается, что около половины белков человека гликозилировано, а 1—2 % генов человека кодируют белки, связанные с гликозилированием. К редким модификациям относят тирозинирование/детирозинирование и полиглицилирование тубулина.

Исключительное значение посттрансляционных модификаций для нормального функционирования организма подтверждается тем, что существуют заболевания, в основе которых лежит нарушение системы посттрансляционной модификации белков (муколипидоз, болезнь Альцгеймера, различные виды рака). На сегодняшний день для изучения Посттрансляционной модификации применяют методы масс-спектрометрии и истерн-блоттинга.

Модификации главной цепи

удаление N-концевого остатка метионина

ограниченный протеолиз:

Ограниченный протеолиз — процесс расщепления одной или нескольких пептидных связей в молекуле белка ферментом-протеазой. Ограниченный протеолиз является одной из регуляторных посттрансляционных модификаций. Ограниченный протеолиз может изменять такие свойства белка, как ферментативная активность, способность связываться с другими белками, внутриклеточная локализация.

Примеры ограниченного протеолиза

Ограниченный протеолиз может использоваться клеткой для разных целей:

для отщепления N- и С-концевых сигнальных последовательностей в процессе внутриклеточного транспорта белка;

для удаления вспомогательной части полипептидной цепи пробелка, которая помогает формировать правильную третичную структуру (С-пептид в проинсулине);

для активации предшественников ферментов (пищеварительные ферменты, протеазы свёртывания крови);

для изменения локализации белка (некоторые цитоплазматические белки переходят в ядро после ограниченного протеолиза: SREBP, NF-κB[4], YB-1);

для получения физиологически активных олигопептидов из белка-предшественника (расщепление проопиомеланокортина с образованием эндорфина, адренокортикотропного гормона, α- и γ-меланоцитстимулирующих гормонов и других физиологически активных пептидов);

разрезание перемычки между доменами белка, при этом домены обычно остаются в контакте друг другом (созревание дифтерийного токсина, формирование фактора пролиферации клеток HCF-1;

для разделения белковых глобул в полибелках (это характерно для вирусов);

для получения нескольких изоформ белка (ограниченный протеолиз белков Stat5 и Stat6 приводит к формированию их изоформ, лишённых доменов, активирующих транскрипцию)

Присоединение небольших химических групп

N-ацилирование

N-аргинилирование

C-амидирование

Ацилирование — введение ацильного остатка RCO- (ацила) в состав органического соединения, как правило, путём замещения атома водорода, введение остатка уксусной кислоты CH3CO- называют ацетилированием, бензойной C6H5CO- — бензоилированием, муравьиной HCO- — формилированием. В зависимости от атома, к которому присоединяется ацильный остаток, выделяют C-ацилирование, N-ацилирование, O-ацилирование.

В качестве ацилирующих агентов используют галогенангидриды и ангидриды кислот.

При C-ацилировании по Фриделю-Крафтсу катализатором обычно служит хлорид алюминия:

В реакциях ацилирования в отличие от реакций алкилирования берется не каталитическое, а эквивалентное количество хлорида алюминия, так как он образует каталитически неактивный аддукт с образующимся кетоном

Присоединение гидрофобных групп для локализации в мембране

N-миристоилирование

присоединение гликозилфосфатидилинозитола (GPI):

Гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ-якорь, GPI anchor) — это гликолипид, который может присоединяться к C-концу белка в процессе посттрансляционной модификации. Он состоит из фосфатидилинозитольной группы, соединенный углеводным связующим звеном (глюкозамин и манноза, гликозидно связанным с остатком инозитола) с C-концевой аминокислотой зрелого белка. Две жирные кислоты, составляющие фосфатидил-инозитоловую группу, заякоривают белок в клеточной мембране.

Белки, принимающие ГФИ, содержат сигнальную последовательность на C-конце, направляющую их в эндоплазматическую сеть. Эта последовательность состоит из гидрофобных аминокислот и погружается в мембрану ЭС и впоследствии отщепляется, замещаясь ГФИ-якорем.

Белок по секреторному пути проходит аппарат Гольджи и выделяется в межклеточное пространство, где с помощью якоря удерживается на внешнем слое плазмалеммы. Поскольку такие белки держатся на мембране исключительно при помощи ГФИ-якоря, его отщепление при помощи фосфолипаз приводит к высвобождению белка, причем процесс этот контролируемый. Такое отщепление используется в исследованиях.

Фермент фосфолипаза C расщепляет фосфоглицериновую связь в белках данным типом посттрансляционной модификации. Обработка фосфолипазой С приводит к отделению мембранных белков от плазматической мембраны. Маркер Т-клеток Thy-1 (ацетилхолинэстераза), а также кишечная и плацентарная щелочные фосфатазы являются гликозилфосфатидилинозитолированы и высвобождаются при обработке фосфолипазой С.

Считается, что белки, содержащие ГФИ предпочтительно размещаются в липидных рафтах, что позволяет предположить высокий уровень организации плазматической мембраны микродоменов.

Модификации боковых цепей аминокислот

Присоединение или отщепление небольших химических групп

N-гликозилирование

O-гликозилирование

гидроксилирование

ацетилирование

метилирование

γ-карбоксилирование

O-сульфонирование

фосфорилирование

йодирование

окисление

гликирование

образование дисульфидных связей

деиминирование

карбомоилирование

дезамидирование

Присоединение гидрофобных групп для локализации в мембране

пренилирование — присоединение остатков изопреноидов (фарнезила и геранилгеранила)

S-пальмитоилирование

Присоединение других белков и пептидов

убиквитинирование

сумоилирование