25. Инициация, элонгация и терминация транскрипции, промотор и терминатор.

Различают три этапа транскрипции: инициацию, элонгацию и терминацию. Инициация. На стадии инициации РНК-полимераза, взаимодействуя с промотором, образует двойной закрытый комплекс, так он называется, потому что состоит из двух компонентов РНК-полимеразы и ДНК, цепи которой в пределах комплекса соединены водородными связями между комплементарными основаниями. Затем происходит плавление ДНК на небольшом участке, таким образом, формируется двойной открытый комплекс, и затем начинает синтез молекулы РНК. После образование первых фосфодиэфирных мостиков между рибонуклеотидами двойной

комплекс переходит в тройной комплекс. На этом заканчивается стадия инициации.

Элонгация. Стадия элонгации иРНК имеет ряд аналогий с элонгацией ДНК. В качестве предшественников для нее необходимы рибонуклеозидтрифосфаты. Этап элонгации транскрипции, т.е. рост цепи иРНК, происходит путем присоединения рибонуклеозидмонофосфатов к 3'-концу цепи с одновременным освобождением пирофосфата. Копирование у эукариот обычно осуществляется на ограниченном участке ДНК (т.е. в пределах гена), хотя у прокариот в ряде случаев транскрипция может проходить последовательно через несколько сцепленных генов (цистронов), формирующих единый оперон, и с одного общего промотора. В таком случае образуется полицистронная иРНК.

Терминация. Транскрипция завершается в специфическом участке ДНК, содержащем терминирующую последовательность. В клетках Е. сoli выявлен особый белок (ро-фактор), повышающий точность терминации. Белок присоединяется к 5'-концу растущей иРНК и продвигается по ней, постепенно приближаясь к ДНК и как бы преследуя РНК-полимеразу. В момент, когда РНК-полимераза останавливается в сайте-терминаторе, фермент захватывается ро-фактором и сбрасывается с ДНК. Терминатор содержит особую последовательность оснований, прочитывающуюся одинаково в обеих цепях ДНК, но в противоположных направлениях.

Промотор — участок связывания фермента, осуществляющего транскрипцию ДНК - РНК-полимеразы. Является местом начала транскрипции. Представляет собой короткую последовательность из нескольких десятков нуклеотидов ДНК, с которой специфически связывается РНК-полимераза. Кроме того, промотор определяет, какая из двух цепей ДНК будет служить матрицей для синтеза иРНК.

Терминатор - участок в конце оперона, сигнализирующий о прекращении транскрипции.

Вопрос 26. Транскрипция у прокариот, строение оперонов на примере lac-оперона.

ТРАНСКРИПЦИЯ ПРОКАРИОТ

Прокариоты содержат одну РНК-полимеразу, состоящую изнескольких субъединиц. Наиболее изучена РНК-полимераза E.coli. Этот фермент состоит из субъединиц, обозначаемых буквами греческого алфавита а, b, b' и сигма. РНК-полимераза может существовать вдвух формах - в форме холофермента, его субъединичный составвыражается формулой α₂ββ'ϭ и кор-фермента - α₂ββ'. Только холофермент может инициировать синтез РНК. После инициации транскрипции -ϭсубъединица отделяется и элонгацию осуществляет кор-фермент. Таким образом,ϭ-субъединица, или ее еще называют ϭ-фактор, необходима для узнавания промотора, β-субъединица участвует в связывании НТФ, β'-субъединица взаимодействует с ДНК,комплекс α₂β'специфически связывается с промоторными нуклеотидными последовательностями. При взаимодействии с ДНК РНК-полимераза «закрывает» участок размером 60 п.н.

В клетке Е.соli присутствуют несколько ϭ-факторов, они ответственны за узнанание РНК-полимеразой различных промоторов. Какправило ϭ-факторы узнают блоки, отстоящие от точки начала транскрипции приблизительно на 10 и 35 нуклеотидов. Эти блоки имеют консервативные (общие для всех в пределах одной группыпромоторов) нуклеотидные последовательности.

Различные ϭ-факторы отвечают за узнавание различных групп промоторов и обеспечивают транскрипцию определенных генов .

Инициация транскрипции включает образование двойного закрытого комплекса, затем формируется двойной открытый комплекс ипосле этого происходит синтез коротких олигорибонуклеотидов. После того, как синтезируется фрагмент РНК более 9 нуклеотидов, ϭ-фактор необратимо диссоциирует и транскрипция вступает а стадиюэлонгации. Элонгацию осуществляет кор-фермент - α₂ββ'.

В процессе элонгации транскрипции образуется дуплекс РНК-ДНК, размер которого составляет около 12 пар нуклеотидов.

Кор-фермент способен синтезировать РНК со скоростью около40 нуклеотидов в секунду.

При достижении терминатора кор-фермент завершает синтезРНК. У прокариот существует два типа терминаторов: р-зависимые ир-независимые. На р-зависимых терминаторах терминация осуществляется в присутствии белкового р-фактора. Такая терминация носитназвание р-зависимой терминации. Терминация транскрипции на независимых от р-фактора терминаторах называется р-независимойтерминацией.

р-Независимая терминация обеспечивается образованиемшпильки на PНК в процессе транскрипции и следующей за ней олигоуридиловой последовательностью. Шпилька приводит к паузе втранскрипции, а олигоуридил-олигоадениловый дуплекс, как наименее стабильный, диссоциирует во время паузы .

В случае р-зависимой терминации на синтезируемой РНК находится участок, с которым взаимодействует р-фактор. р-Фактор является НТФазой и способен испашзовать энергию гидролиза НТФ для движения но молекуле РНК от места посадки, расположенного в области 5'-конца РНК, в сторону ее З'-конца. Как только р-фактор «догонит» работающую РНК-полимеразу, происходиттерминация транскрипции .

Виды оперонов Оперон — это тесно связанная последовательность структурных генов, определяющих синтез группы белков, которые участвуют в одной цепи биохимических преобразований. К наиболее хорошо изученным оперонам бактерий относят:Лактозный (lac)-оперонГалактозный (gal)-оперонТриптофановый (trp)-оперонРассмотрим механизмы регуляции активности генов на примере лактозного оперона кишечной палочки.

Лактозный оперон Оперон – участок бактериальной хромосомы, включающий следующие участки ДНК: Р – промотор, О – оператор, Z, Y, А – структурные гены, Т –терминатор. (В состав других оперонов может входить до 10 структурных генов.)Промотор – место присоединения РНК- полимеразы.Оператор – участок оперона, к которому присоединяются белки-репрессоры или активаторы транскрипции.Структурные гены – гены кодирующие ферменты, участвующие в метаболизме лактозы. Терминатор служит для отсоединения РНК-полимеразы после окончания синтеза иРНК, соответствующей ферментам Z, Y, А, необходимым для усвоения лактозы.

Структурные гены лактозного оперона — lacZ, lacY и lacA:

• lacZ кодирует фермент β-галактозидазу, которая расщепляет дисахарид лактозу на глюкозу и галактозу,

• lacY кодирует β-галактозид пермеазу, мембранный транспортный белок, который переносит лактозу внутрь клетки.

• lacA кодирует β-галактозид трансацетилазу, фермент, переносящий ацетильную группу от ацетил-КoA на бета-галактозиды.

Для катаболизма лактозы необходимы только продукты генов lacZ и lacY, роль продукта гена lacA не ясна. Возможно, что реакция ацетилирования дает бактериям преимущество при росте в присутствии определенных неметаболизируемых аналогов бета-галактозидов, поскольку эта модификация ведет к их детоксикации и выведению из клетки.