21.Мини-транспозоны

Для переноса генов особенно удобны мини-Ми фаги (Resibois et al., 1981). Так называют фаги Ми, у которых после операций in vivo (или in vitro) утрачиваются литические функции, но сохраняются, по крайней мере, концы ДНК и ген А (например, Ми18Л). Без фага-помощника мини-Mu фаги могут интегрироваться в бактериальную хромосому, образовывать делеций и вызывать слияние репликонов. Если же у мини-Mu фага сохраняются и другие ранние функции, как, например, у МиА26, он, кроме того, способен осуществлять перенос бактериальных фрагментов. Мини-Mu фаг Ми40, утративший все существенные гены, переносит гены только в присутствии фага-помощника. Крут возможностей мини-Ми фагов существенно расширился после введения в них различных репликаторов, маркеров антибио-тикоустойчивости и генов-репортеров (Groisman, Casadaban, 1986). Это позволило не только извлекать гены из хромосомы и переносить их, но также проводить их анализ и мультипликацию (клонирование).

Мини-Mu фаги отличаются целым рядом преимуществ перед другими транспозонами в плане осуществления геномных перестроек и клонирования ДНК in vivo:

1) у них высока частота транспозиции;

2) нет специфичности к сайтам интеграции;

3) достаточно широк круг хозяев;

4) ими можно управлять с помощью термочувствительного репрессора (продукт гена с);

5) мини-Ми ДНК упаковывается in vivo в фаговые головки, поэтому ее можно переносить в другие клетки путем их инфекции.

Фаги Ми и мннн-Ми могут трансдуцировать бактериальные гены благодаря тому, что на концах их ДНК (в основном на правом конце, где локализуется ген S) имеются вариабельные по длине и нуклеотидным последовательностям участки бактериальной ДНК. На 5-концах эти участки достигают 1—2 т.п.н. Их размер определяется разностью между емкостью фаговой головки (38 т.п.н.) и длиной Ми ДНК (37 т.п.н.). Здесь может располагаться целый бактериальный ген, который фаг Ми способен переносить и который с частотой 10~9—10~7 может встроиться в бактериальную хромосому за счет RecA-зависимой рекомбинации. Фаг мини-Mu осуществляет ту же трансдукцню с частотой на два порядка выше, так как из-за небольшого размера его ДНК (несколько тысяч пар нуклеотидов) длина участка бактериальной ДНК на ^-концах может достигать 30 т.п.н.

При репликации ДНК мини-Ми фагов некоторые фрагменты бактериальной ДНК размером до 25—30 т.п.н. могут оказаться между двумя мини-Mu ДНК, находящимися в одной ориентации. Такие структуры ведут себя как транспозоны. После упаковки в фаговые головки и последующей инъекции в клетки они способны интегрироваться в случайные места клеточной хромосомы. Этот способ RecA-независимой трансдукции получил название мини-мюдукции. Мини-мюдукцию используют, например, для переноса и интеграции методами in vivo чужеродных генов, когда RecA-зави-симая рекомбинация неприменима. Частота мини-мюдукции низка, поэтому используют мини-Mu фаги с селективным маркером. Например, в мини-Mu фаг Ми 1&4 был введен гены а, позволяющий отбирать мини-мюдуктанты по их устойчивости к ампициллину.