31. Застосування люмінесцентної мікроскопії для діагностики вірусів

Суть методу полягає у вторинно-наведеній флюоресценції біологічних об’єктів при обробці їх розчинами різних флюорохромів. При цьому препарати для мікроскопії готують з клітин інфікованого листя(для фітовірусів), клітин ссавців, комах і т.д. Після відповідної фіксації і промивки зразки обробляють флуоресцентними барвниками(акрединовим оранжевим). Зазвичай беруть водний розчин цих барвників дуже низької концентрації, щоб не пошкодити клітину. Після підготовки зразки досліджують при різних інструментальних збільшеннях, з відповідними світлофільтрами(зазвичай пропускають УФ – діапазон спектра).

Переваги цього методу:

1. Поєднує кольорове зображення з контрасністю

2. Можна вивчати локалізацію вірусу в клітині, вибірково зв’язуючі його з різними флюорохромами.

3. Можна визначати функціонально – морфологічні зміни клітин під впливом віруса

4. Можна вивчати живі інфіковані клітини в середовищі

32. Застосування електронної мікроскопії для діагностики вірусів

У зв'язку з дуже маленькими розмірами вірусних часток їх практично неможливо роздивитися за допомогою світлового мікроскопа(крім віспи і мінівірусів) – його роздільної здатності для цього недостатньо. Саме тому, лише з винайденням електронного мікроскопу стало можливим вивчати морфологію віріонів, адже його роздільна здатність досягає 4-5 анстрем. Діагностика вірусів за допомогою ЕМ базується на ідентифікації вірусів за їх характерною морфологією. Головна перевага діагностики за допомогою ЕМ – можливість візуалізувати вірус. Можливо ідентифікувати вірус безпосередньо без попереднього вивчення вірусного агента. Інша перевага методу – це швідкість діагностики. Препарат може бути розглянутим протягом декількох хвилин після приготування препарату з вірусвмісної рідини. Головний недолік – неможливість дослідити багато матеріалу, також для вичвлення повина бути певна концентрація вірусних часток. Деякі віруси (вірус саркоми Рауса) мають нечітку морфологію, що робить їх детекцію дуже складною.(см. № 35)

33. Принцип дії електронного мікроскопу

У вакуумній камері розміщені катод і анод. Під впливом різниці напруг між ними відбувається емісія електронів з катоду(V – подібна вольфрамова нитка), вони прямують до анода(металева пластинка з отвором) – та їх частина, яка пройде через отвір анода, і створює електронний промінь. Вакуум створюється спеціальними насосами, для того, щоб молекули газів не гальмували електрони. Далі електронний промінь проходить конденсорну лінзу, і прямує до препарату. При проходженні через нього частина електронів розсіюється, частина поглинається а решта проходить наскрізь. Ті електрони що пройшли наскрізь утворюють зображення, яке збирає об’єктивна, і збільшує проектуюча магнітні лінзи. Електрони, проходячи через речовину обєкту, змінюють свої траєкторії – розсіюються. Число розсіяних електронів збільшується зі збільшенням густини досліджуваної речовини, її атомного номера, товщини зразку та зменшенням енергії електронів. Щоб затримувати електрони природнім об’єктам потрібне контрастування, при якому певні їх структури зв’язуються з атомами важких металів, і набувають здатності не пропускати електрони. В цьому місці на зображенні буде темна область. Це позитивне контрастування. Значно частіше у вірусології застосовують негативне – коли контрастують фон, а не сам об’єкт.

Далі електрони попдають на люмінесцентний екран. Вони передають йому свою енергію, після чого молекули екрану будуть випромінювати її у вигляді світіння. В іншому випадку зображення передається на фотопластинку. Практично неконтрастовані частки невеликих вірусів, розташовані на підтримуючій плівці, спостерігаються в ЕМ в вигляді безструктурних плям, тому біологічні обєкти необхідно контрастувати.

Для ЕМ характерна велика ймовірність виникнення артефактів. Це повязано з процесом фіксації та висушування, а також з процесом контрастування.