2. Принципы культивирования бактерий. Искусственные питательные среды. Их классификация и характеристика. Требования, предъявляемые к питательным средам.

В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на питательных средах, которые должны быть стерильными, про­зрачными, влажными, содержать определенные питательные вещества (белки, углеводы, витамины, микроэлементы и др.), обладать определенной буферностью, иметь соответствующий рН, окислительно-восстановительный потенциал. Питательные среды классифицируют по консистенции-—жидкие, полужид­кие, плотные (твердые); происхождению — животного или ра­стительного происхождения и синтетические среды (искусственные), приготов­ленные из определенных химически чистых соединений в точ­но указанных концентрациях, по назначению — общеупотреби­тельные (универсальные), дифференциальные (позволяют различать бактерии разных видов и родов по их культуральным и биохимическим свойствам), элективные и среды обогащения, специальные.

Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного про­исхождения с добавлением неорганических солей, угле­водов и азотистых веществ. В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин—кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.

Искусственные среды разделяют на животные (например, мясопептонный агар (МПА) или мясопептонный бульон (МПБ)) и растительные (например, настои сена и соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.).

3.Микрофлора почвы. Факторы, влияющие на количественный и качественный состав видов почвенных бактерий. Санитарно-бактериологическая оценка почвы. Почва как фактор микробного обсеменения лекарственных растений.

Почва является главным резервуаром и естественной средой обитания микроорганизмов, которые принимают участие в процессах формирования и очищения почвы, а также круговорота веществ в природе.

Жизнедеятельность микроорганизмов в почве, их качественный и количественный состав определяется почвенными условиями: наличием питательных веществ, влажностью, аэрацией, реакцией среды, температурой и т.д.

Большое влияние, как на общую численность, так и на соотношение отдельных систематических групп микроорганизмов оказывает тип почвы. Различаясь по физическим и химическим свойствам почва представляет различную среду для жизнедеятельности микроорганизмов. Их больше в увлажненной и обработанной почве (4,2-5,2 млрд/г), меньше в лесной почве, в песках (0,9-1,2 млрд/г). Наиболее обильна микрофлора в верхнем горизонте почвы глубиной 2,5-15 см. В этом слое протекают основные биохимические процессы превращения органических веществ, обусловленные жизнедеятельностью микроорганизмов. На глубине 4-5 м число микроорганизмов значительно снижается, так как уменьшается количество питательных веществ и ухудшаются условия аэрации.

В составе микрофлоры почвы выделяют следующие группы микроорганизмов:

1. бактерии аммонификаторы, вызывающие гниение трупов животных, остатков растений, разложение мочевины с образованием аммиака и других продуктов: аэробные бактерии – B. subtilis, B. mesentericus, Serratia marcescens; бактерии рода Proteus; грибы рода Aspergillus, Mucor, Penicillium; анаэробы – C. sporogenes, C. putrificum; уробактерии – Urobacillus pasteuri, Sarcina urea, расщепляющие мочевину;

2. нитрифицирующие бактерии: Nitrobacter и Nitrosomonas (Nitrosomonas окисляют аммиак до азотистой кислоты, образуя нитриты, Nitrobacter превращают азотистую кислоту в азотную и нитраты);

3. азотфиксирующие бактерии: усваивают из воздуха свободный кислород и в процессе своей жизнедеятельности из молекулярного азота синтезируют белки и другие органические соединения азота, используемые растениями;

4. бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора и других элементов – серобактерии, железобактерии и т.д. (серобактерии окисляют сероводород до серной кислоты, железобактерии окисляют соединения железа до гидрата окиси железа, фосфорные бактерии способствуют образованию легко растворимых соединений фосфора);

5. бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие брожение (молочнокислые, спиртовые, маслянокислые, уксусные, протионовые и др.).

С выделениями человека и животных, с фекально-бытовыми сточными водами в почву могут попадать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы (возбудители грибковых заболеваний, ботулизма, столбняка, газовой гангрены, сибирской язвы, бруцеллеза, лептоспироза, кишечных инфекций и др.).

Для того, что бы провести санитарно-бактериологическую оценку почвы проводят санитарно-бактериологическое исследование почвы. При исследовании почвы может проводиться полный или краткий анализ.

Полный санитарно-бактериологический анализ почвы проводится:

а) для подробной и глубокой характеристики санитарного состояния почвы;

б) для определения пригодности почвы при размещении жилья, мест отдыха, детских учреждений и водопроводных сооружений;

в) для эпидемиологических исследований.

Краткий анализ рекомендуется при осуществлении текущего санитарного надзора и включает определение общего количества сапрофитных бактерий, БГКП (коли-титр и коли-индекс), клостридий (перфрингенс-титр), термофильных бактерий, нитрифицирующих.

В полный санитарно-бактериологический анализ входят дополнительно: определение актиномицетов, грибов, сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, бруцеллеза, сибирской язвы.

После проведенных исследований выносят соответствующую оценку.

Ее производят по комплексу показателей. Для санитарной оценки почвы необходимо пользоваться показателями.

Схема санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям

Категория почв	Титры		Число термофильных бактерий в 1 г
	коли-титр	перфрингенс-титр
Чистая	1 и выше	0,01 и выше	100-1 000
Загрязненная	0,9-0,01	0,009-0,0001	1 000-100 000
Сильно загрязненная	0,09 и ниже	0,00009 и ниже	100 000-4 000 000

Микроорганизмы являются постоянными спутниками не только человека и животных, но и, в равной степени, высших растений, в том числе используемых в качестве лекарственного сырья. Микроорганизмы поселяются и ведут активный образ жизни, как на поверхности, так и внутри зеленых частей растений, их корней, семян, плодов. Для приготовления лекарств служат самые разнообразные растения и работники аптечных учреждений, фармацевтических фабрик и заводов должны обеспечивать сохранность лекарственного сырья от микробной порчи.

Все микроорганизмы, населяющие лекарственные растения, можно разделить на две группы:

1. представители нормальной микрофлоры растений;

2. фитопатогенные микроорганизмы - возбудители заболеваний растений.

Нормальная микрофлора растений представлена ризосферными и эпифитными микробами.

Зона почвы, находящаяся в контакте с корневой системой растений, носит название ризосферы, а микроорганизмы, развивающиеся в данной зоне, называются ризосферными. Условно различают два типа ризосферы: ближнюю и отдаленную.

Инфекционные болезни растений вызываются фитопатогенными бактериями. Заражение растений происходит через инфицированные семена, почву, грунтовые и дождевые воды, насекомых. Главным источником инфекции является почва, так как в ней могут содержаться остатки неперегнивших полностью больных растений.

Фитопатогенные микроорганизмы сравнительно легко могут проникать в растения через естественные образования (чечевички, нектарники, желёзки, корневые волоски) и искусственные повреждения, даже ничтожные царапины. Некоторые микроорганизмы, способны вырабатывать ферменты, гидролизирующие кутикулу растений и облегчающие внедрение возбудителя.

Попав в растение и достигнув критической концентрации в количественном отношении, микроорганизмы вызывают заболевания, называемые бактериозами. Различают общие бактериозы - поражение всего растения вследствие распространения возбудителя в сосудистой системе; и местные или очаговые – поражения на листьях, стволах, ветвях, корнях и корневищах, возникающие при интрацеллюлярном распространении микроба.

От начала заражения до момента проявления у растения симптомов болезни проходит инкубационный период, длительность которого различна и зависит от многих факторов: температуры, влажности, света, питания и др.

Существенно важным является, то обстоятельство, что в больных растениях заметно отклоняются от нормы обменные процессы вплоть до качественных изменений клеточных структур, что приводит к нарушению химического состава тканей и снижению содержания действующих начал в лекарственных растениях, и использование их в качестве сырья в аптечных и заводских условиях становится невозможным.

Растительный организм обладает защитными механизмами, противодействующими внедрению и размножению фитопатогенных бактерий. К ним можно отнести особенности покровных тканей, высокую кислотность клеточного сока, образование биологически активных веществ – фитонцидов, подавляющих развитие микробов.

Меры профилактики. Заключаются в дезинфекции семян и посадочного материала, дезинфекции почвы, опрыскивании растений химическими веществами, уничтожении растительных остатков, переносчиков возбудителей, удалении больных растений и изоляции здоровых.

Существующая классификация фитопатогенных бактерий несовершенна, не всегда определена их родовая и видовая принадлежность.

Фитопатогенные бактерии относятся к родам: Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Corynebacterium, Pectobacterium, Rhisobium (табл. 6).

Известно, что вирусы вызывают более 20% болезней растений. Большинство вирусов относится к семейству Reoviridae, родам Phytoreovirus, Fijvirus.

Из фитопатогенных грибов следует отметить два класса – аскомицеты (Ascomycetes), и несовершенные грибы (Fungi imperfecti).

Лекарственное растительное сырье может обсеменяться микробами на всех этапах заготовки (сбор, первичная обработка, сушка, измельчение, упаковка) и хранения. При хранении сырья важно соблюдение санитарного режима в аптеках. Неблагоприятное действие оказывают: влажность, пыль, насекомые и другие факторы, повышающие микробное обсеменение и приводящие к порче лекарственного сырья.

4. Санитарно-бактериологическое исследование смывов с аптечной посуды и оборудования аптек. Значение санитарно-бактериологических исследований в оценке санитарного состояния аптеки и качестве изготовления лекарств.

С целью проверки качества мытья посуды, санитарного состояния аптек, соблюдения правил личной гигиены персоналом проводят санитарно-бактериологическое исследование аптечной посуды, оборудования, рабочих столов, полотенец, санитарной одежды и рук аптечных работников.

Для определения микробной загрязненности используют метод смывов с поверхности исследуемых объектов стерильным физиологическим раствором.

Приготовление смывов. Для исследования используют 3 флакона. В один из флаконов наливают 10 мл стерильного физиологического раствора, ополаскивают внутреннюю поверхность сосуда, переливают во второй и третий флаконы, последовательно ополаскивая их.

Пробки (корковые, полиэтиленовые, резиновые) в количестве 5 штук стерильным пинцетом помещают в широкогорлую стерильную колбу, закрытую ватно-марлевой пробкой, заливают 10 мл стерильного физиологического раствора и тщательно прополаскивают.

Воронки, пробирки, пипетки ополаскивают 10 мл стерильного физиологического раствора.

Смыв со стола производят с поверхности 100 см², для чего используют специальные трафареты из проволоки или жести, стерилизуемые прокаливанием перед взятием смывов. Смыв осуществляется стерильным ватным тампоном, помещенным в пробирку с 2 мл стерильного физиологического раствора (тампон не должен касаться поверхности раствора). Непосредственно перед взятием смыва тампон смачивают физиологическим раствором, тщательно протирают поверхность стола ограниченную трафаретом, помещают в пробирку, в которую добавляют 8 мл стерильного физиологического раствора и тщательно тампон прополаскивают.

Смывы исследуют на общее бактериальное загрязнение (ОМЧ), на наличие кишечной палочки и золотистого стафилококка; обнаружение которых свидетельствует о грубых нарушениях санитарного режима в аптеках.

Определение микробного числа. 1 мл смыва вносят в стерильную чашку Петри, заливают 12-15 мл расплавленного и остуженного до 45⁰С МПА, тщательно перемешивают содержимое чашки и после застывания агара ее помещают в термостат на 24-48 час. Подсчитывают количество выросших колоний, умножают на 10 и определяют общую микробную обсемененность объекта.

Микробной порче подвергаются также и готовые лекарственные формы. Под лекарственной формой понимают одно или несколько лекарственных веществ, подвергшихся специальной обработке, в результате которой им придана удобная для применения больным форма. В аптеках изготовляют следующие лекарственные формы: сухие (порошки, сборы), жидкие (микстуры, настои, отвары, капли), мягкие (мази, пасты, шарики, свечи) и стерильные инъекционные препараты. Лекарства с повышенной обсемененностью микробами, особенно патогенными, могут вызывать инфекционные заболевания у людей, кроме того, размножение микроорганизмов в лекарственных средствах ведет к изменению их физических и органолептических свойств, а в отдельных случаях и к превращению лекарств в токсический продукт.

Микробная обсемененность лекарственных препаратов зависит от соблюдения в аптеке санитарно-гигиенического режима. Причиной микробного обсеменения готовых лекарств может быть микробное загрязнение растительного лекарственного сырья, воздуха производственных помещений, оборудования, посуды, дистиллированной воды, рук персонала.

Инъекционные препараты, глазные капли и мази, препараты для новорожденных должны быть стерильными.

Предупреждение микробной порчи готовых лекарственных веществ возможно при соблюдении условий, исключающих их микробное загрязнение: соблюдение правил личной гигиены фармацевтами, качественное обеззараживание воздуха аптечных помещений, правильная обработка посуды, оборудования, при необходимости (стерильные лекарственные формы) асептическое изготовление лекарств.

Именно с этой целью в аптеках работниками государственного санитарно-эпидемиологического надзора согласно инструкции, утвержденной приказом Министерства здравоохранения, не менее двух раз в квартал осуществляется бактериологический контроль.

5. Антибиотики. Классификация антибиотиков по источнику получения, способу получения, химической структуре, механизму и спектру действия. Побочные эффекты при антибиотикотерапии. Механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам и пути ее преодоления.

Антибиотики (от греч.anti bios — против жизни) — химио- терапевтические вещества, продуцируемые микроорганизмами, животными клетками, растениями, а также их производные и синтетические продукты, которые обладают избирательной способностью угнетать и задерживать рост микроорганизмов, а также подавлять развитие злокачественных новообразований.

В зависимости от источника получения различают шесть групп антибиотиков: 1. Антибиотики, полученные из грибов, например рода Penicillium (пенициллины, гризеофульвин), рода Cephalosporium (цефалоспорины) и т.д.; 2. Антибиотики, полученные из актиномицетов; группа включает около 80 % всех антибиотиков. Среди актиномицетов основное значение имеют представители рода Streptomyces, являющиеся продуцентами стрептомицина, эритромицина, левомицетина, нистатина и многих других антибиотиков;

3. Антибиотики, продуцентами которых являются собственно бактерии. Чаще всего с этой целью используют представителей родов Bacillus и Pseudomonas. Примерами антибиотиков данной группы являются полимиксины; бацитрацин; 4. Антибиотики животного происхождения; из рыбьего жира получают эктерицид; 5. Антибиотики растительного происхождения. К ним можно отнести фитонциды, которые выделяют лук, чеснок, другие растения. В чистом виде они не получены, так как являются чрезвычайно нестойкими соединениями. Антимикробным действием обладают многие растения, например ромашка, шалфей, календула;

6. Синтетические антибиотики.

Химическая классификация

1. Беталактамы (пенициллины, цефалоспорины, карбопинемы, монобактамы);

2. Макралиды и азалиды азитромицин, эритромицин, кларитромицин и др);

3. Тетрациклины (тетрациклин, диксициклин);

4. Левомицетины (левомицетин);

5. Аминогликозиды (гентамицин, тобрамицин);

6. Гликопептиды (ванкомицин);

7. Анзамицины (рифампицин);

8. Линкозамиды (линкомицин, клиндамицин);

9. Полипептиды, липопетиды;

По способу получения

Существуют три способа получения антибиотиков. Биологический синтез. Для получения антибиотиков этим способом используют высокопродуктивные штаммы микроорганизмов и специальные питательные среды, на которых их выращивают. С помощью биологического синтеза получают, например, пенициллин.

Химический синтез. После изучения структуры некоторых природных антибиотиков стало возможным их получение путем химического синтеза. Одним из первых препаратов, полученных таким методом, был левомицетин. Кроме того, с помощью этого метода созданы все синтетические антибиотики. Комбинированный метод. Этот метод представляет собой сочетание двух предыдущих: с помощью биологического синтеза получают антибиотик, выделяют из него так называемое ядро (например, 6-аминопенициллановую кислоту из пенициллина) и химическим путем добавляют к нему различные радикалы.

По спектру действия

Различают антибиотики широкого спектра действия и узкого. К антибиотикам широкого спектра действия относятся аминогликозиды, тетрациклины и др. Антибиотики узкого спектра действия эффективны в отношении небольшого круга бактерий, например полимиксины действуют на грациликутные, ванкомицин влияет на грамположительные бактерии.

По механизму действия

Антибактериальное действие антибиотиков может быть бактерицидным, т. е. вызывающим гибель бактерий (например, у пенициллинов, цефалоспоринов), и бактериостатическим — задерживающим рост и развитие бактерий (например, у тетрациклинов, левомицетина).

При увеличении дозы бактериостатические антибиотики могут также вызывать гибель бактерий.

Действие антибиотиков на микроорганизмы связано с их способностью подавлять те или иные биохимические реакции, происходящие в микробной клетке. В зависимости от механизма действия различают пять групп антибиотиков: 1. Антибиотики, нарушающие синтез клеточной стенки. К этой группе относятся, например, р-лактамы. Препараты этой группы характеризуются самой высокой избирательностью действия: они убивают бактерии и не оказывают влияния на клетки микроорганизма, так как последние не имеют главного компонента клеточной стенки бактерий — пептидогликана. В связи с этим р-лактамные антибиотики являются наименее токсичными для макроорганизма;

2. Антибиотики, нарушающие молекулярную организаию и синтез клеточных мембран. Примерами подобных препаратов являются полимиксины, полиены;

3. Антибиотики, нарушающие синтез белка; это наиболее многочисленная группа препаратов. Представителями этой группы являются аминогликозиды, тетрациклины, макролиды, левомицетин, вызывающие нарушение синтеза белка на разных уровнях; 4. Антибиотики — ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот. Например, хинолоны нарушают синтез ДНК, рифампицин — синтез РНК;

5. Антибиотики, подавляющие синтез пуринов и аминокислот. К этой группе относятся, например, сульфаниламиды.

Побочное действие антибиотиков

1. Токсические реакции. Токсическое действие антибиотиков зависит от свойств препарата, его дозы, способа введения, состояния больного. Среди осложнений этой группы на первом месте стоит поражение печени. Подобным действием обладают, например, тетрациклины. Второе место занимают антибиотики с нефротоксическим действием, например аминогликозиды: повреждение печени и почек связано с их обезвреживающей и выделительной функциями. Аминогликозиды могут также вызывать необратимое поражение слухового нерва. Левомицетин может поражать органы кроветворения, он же обладает эмбриотоксическим действием. Цефалоспорины III поколения нарушают синтез витамина К, в результате чего возможны кровотечения. Наименее токсичен из применяемых антибиотиков пенициллин, однако при его длительном использовании возможно поражение ЦНС.

Для предупреждения токсического действия антибиотиков необходимо выбирать наиболее безвредные для данного больного препараты (не назначать, например, нефротоксичные антибиотики больному с поражением почек) и постоянно следить за состоянием органов, для которых антибиотик токсичен.

2. Дисбиозы. При использовании антибиотиков широкого спектра действия наряду с возбудителями заболевания, для уничтожения которых их применяют, погибают и некоторые представители нормальной микрофлоры, чувствительные к этим антибиотикам. Освобождается место для антибиотикорезистентных микроорганизмов, которые начинают усиленно размножаться и могут стать причиной вторичных эндогенных инфекций, как бактериальных, так и грибковых. Например, у больного стафилококковой пневмонией в результате антибиотикотерапии может развиться цистит, вызванный Е. coli. Проявлением дисбиоза может стать также кандидамикоз Подавление антибиотиками нормальной микрофлоры приводит к нарушению ее антагонистической по отношению к патогенным микроорганизмам функции и может способствовать развитию различных заболеваний. Например, использование антибиотиков, подавляющих Е. coli, делает организм более восприимчивым к дизентерии, холере, другим кишечным инфекциям.

Предупредить развитие дисбиоза невозможно, но вполне реально свести до минимума его последствия. Во-первых, по возможности следует использовать антибиотики узкого спектра действия; во-вторых, параллельно антибактериальным антибиотикам назначать противогрибковые препараты; в-третьих, для восстановления нормальной микрофлоры применять эубиотики.

3. Действие на иммунитет. Применение антибиотиков может вызвать аллергические реакции, возникновение которых зависит от свойств препарата (наиболее сильными аллергенами являются пенициллин и цефалоспорины), способа введения и индивидуальной чувствительности больного. Аллергические реакции наблюдаются в 10 % случаев. Могут появиться сыпь, зуд, крапивница и др. Очень редко возникает такое тяжелое осложнение, как анафилактический шок. Для предупреждения этих реакций антибиотики необходимо назначать с учетом индивидуальной чувствительности больного при обязательном тщательном наблюдении за больным после введения антибиотиков. При появлении аллергических реакций антибиотик отменяют.

Принципы рациональной антибиотикотерапии

1. Микробиологический принцип. Антибиотики следует применять только по показаниям, когда заболевание вызвано микроорганизмами, в отношении которых существуют эффективные препараты.

2. Фармакологический принцип. При назначении антибиотика необходимо определить правильную дозировку препарата, необходимые интервалы между введением лекарственного средства, продолжительность антибиотикотерапии, методы введения. Следует знать фармакокинетику препарата, возможности сочетания различных лекарственных средств.

3. Клинический принцип. При назначении антибиотиков учитывают общее состояние больных, возраст, пол, состояние иммунной системы, сопутствующие заболевания, наличие беременности.

4. Эпидемиологический принцип. При подборе антибиотика необходимо знать, к каким антибиотикам устойчивы микроорганизмы в среде, окружающей больного (отделение, больница, географический регион). Распространенность устойчивости к данному антибиотику не остается постоянной, а изменяется в зависимости от того, насколько широко используется антибиотик.

5. Фармацевтический принцип. Необходимо учитывать срок годности и условия хранения препарата, так как при его длительном и неправильной хранении образуются токсичные продукты деградации.