Питання і вправи

До теоретичної частини:

1. Які функції ферментів?

2. В чому різниця між біологічними каталізаторами і каталізаторами, які застосовуються в хімії?

3. В чому полягає особливість будови ферментів?

4. Чому розщеплення крохмалю до декстринів йде швидше при 60°С, а ніж при 80°С?

5. Як впливає концентрація Н на швидкість ферментативних реакцій?

6. Як впливає температура на швидкість ферментативних процесів?

7. Чому сечовина під дією уреази перетворюється на вуглекислий газ і

аміак, а фенілмочевина залишається без змін?

8. За якими ознаками класифікують ферменти? Яка специфіка дії кожного з класів ферментів?

9. Які існують загальні уявлення про механізм дії ферментів?

До експериментальної частини:

10. Як можна довести, що ферменти вразливі до дії високих температур? 11. Як визначають рН середовища?

12. Що таке активатори та інгібітори дії ферментів?

13. Як впливає реакція середовища на активність ферментів?

14.Як можна визначити активність ферментів?

ЛАБОРАТОРНА РАБОТА № 12

Тема: Якісні реакції на вітаміни та їх визначення.

Дослі 12.1 Реакція на тіамін (вітамін В₁). Реакція з діазореактивом.

Принцип методу. Метод заснований на здатності вітаміну В₁ у лужному середовищі з діазореактивом (суміш солянокислого або сірчанокислого розчину сульфенілової кислоти з розчином нітрату натрію) утворювати складну комплексну сполуку оранжевого або червоного кольору.

Матеріали та реактиви. Розчин сульфанілової кислоти (1%), 5% розчин нітриту натрію, 10%розчин карбонату натрію, тіамін (порошок або його 5% розчин).

Обладнання. Штатив із пробірками, піпетки, шпатель.

Хід роботи.

В пробірку вливають 1 мл розчину сульфанілової кислоти та 1 мл розчину нітриту натрія (утворюється діазореактив). Потім у пробірку вносять невелику кількість (на кінчику шпателя) порошка або 0.5 мл розчину тіаміну й по стінці пробірки оборежно додають 1 мл розчину Nа₂СОз. На межі двох рідин з'являється кільце оранжевого або червоного кольору.

Дослідження 12.2 Реакція відновлення рибофлавіну (вітамін В₂).

Принцип методу. Під час змішування металічного цинку з концентрованою соляною кислотою утворюється водень, який відновлює жовтий рибофлавін спочатку на родофлавін (проміжне сполучення) червоного кольору, а потім на безбарвний лейкофлавін:

Матеріали та реактиви. Концентрована соляна кислота, металічний цинк, 0,025% розчин вітаміну В₂ (суспензія рибофлавіну у воді).

Обладнання. Штатив із пробірками, піпетка.

Хід роботи.

В пробірку вливають 1 мл розчину вітаміну В₂, 0.5 мл концентрованої

соляної кислоти й кидають грудочку металічного цинку. Водень, що

виділяється, реагує з рибофлавіном, відновлюючи його. Рідина в пробірці поступово забарвлюється в рожевий колір, а потім знебарвлюється. Під час збовтування знебарвлений розчин лейкофлавіну знову окислюється киснем повітря на рибофлавін

Дослід 12.3 Реакція на піридоксин (вітамін В_б). Реакція з хлоридом

заліза.

Принцип методу. Під час взаємодії піридоксину з розчином хлориду заліза рідина забарвлюється в червоний колір завдяки утворенню комплексної солі типу феноляту заліза.

Матеріали та реактиви. Водний розчин (1%) вітаміну В_б, 1% розчин FеСІз.

Обладнання. Штатив із пробірками, піпетки.

Хід роботи.

У пробірці перемішують 1 мл водного розчину піридоксину та дві краплі розчину хлоріду заліза. Рідина забарвлюється в червоний колір.

Дослід 12.4 Якісні реакції на рутин (вітамін Р).

Принцип методу. Хлорид заліза (3) утворює з рутином комплексні сполуки, забарвлені в смарагдово-зелений колір. Концентрована сірчана кислота утворює з флавонами та флавонолами флавілієві солі, розчини яких мають яскраво -жовте забарвлення.

Під час кислотного гідролізу рутину відщеплюється молекула рутинози. Потім рутиноза розкладається на глюкозу та рамнозу, які мають відновні властивості.

Матеріали та реактиви. Рутин (порошок і насичений водний розчин), 1% розчин хлориду заліза (3), концентрована сірчана кислота, 0.5% розчин соляної кислоти, 10% розчин гідроксиду натрію, реактив Фелінга (реакції на моносахариди):

Обладнання. Штатив із пробірками, піпетки.

Хід роботи.

А. Реакція рутину з хлоридом заліза (3). До 2 мл насиченого водного

розчину рутину додають кілька крапель розчину FеСІз, спостерігають

появу зеленого забарвлення.

Б. Реакція рутину з концентрованою сірчаною кислотою. До 2 мл

насиченого водного розчину рутину обережно по стінці пробірки

доливають 1 мл концентрованої сірчаної кислоти. На межі розділення

двох рідин виникає кільце жовтого кольору.

В. Реакція рутину з реактивом Фелінга. До 0.5 г рутину доливають 5 мл

розчину соляної кислоти, кип'ятять протягом 1 хвилини, потім

фільтрують. До 5 мл фільтрату додають 3 мл розчину гідроксиду натрію

та 3 мл свіжовиготовленого реактиву Фелінга й знову нагрівають до

кипіння. Спостерігають утворення осаду геміоксиду міді червоного

кольору.

Дослід 12.5 Якісна реакція на вітамін С.

Принцип методу. Аскорбінова кислота може легко вступати в окисно - відновні реакції й відновлювати гексоціано -(3) - ферат калію або АgNOз. АgNО звідновлюється до металічного срібла. Кз[Fe(СN)₆] відновлюється на К₄[Fe(СN)_б] який із іонами валентного заліза утворює сіль Fе₄[Fe(СN)₆]₃ синього або зеленого кольору.

Матеріали та реактиви. 0.1% розчин аскорбінової кислоти, 1% розчин Кз[Fe(СN)₆] ; 1% FеСІз .

Хід роботи.

1. До 1 мл розчину аскорбінової кислоти додають 1 мл Кз[Fe(СN)_б] і 0.5 мл розчину FеСІ₃. Спостерігають утворення синьо - зеленого забарвлення.

2. До 1 мл розчину вітаміна С додають 1-2 краплі АgNО₃. Cпостерігають випадіння чорного осаду.

Дослід 12.6 Якісна реакція на вітамін А з сірчаною кислотою.

Принцип методу. Вітамін А з концентрованою сірчаною кислотою в бензольному розчині утворює комплекс синього кольору.

Матеріали та реактиви 0.05% масляний розчин вітаміну А в хлороформі або розчин риб'ячого жиру в хлороформі в співвідношенні 1:5; концентрована сірчана кислота.

Хід роботи.

Реакція Друммонда.

В пробірку до двох-трьох крапель розчину вітаміну А додають дві-три краплі концентрованої сірчаної кислоти. Вміст пробірки забарвлюється в синій колір, який через деякий час змінюється на фіолетовий і бурий.

Дослід 12.7 Якісні реакції на вітамін Є.

Принцип методу. Взаємодія α-токоферолу з концентрованою азотною кислотою зумовлює забарвлення реакційної суміші в червоний колір. Це спричинено тим, що продукт окислення а-токоферолу має хіноїдну структуру. Під час взаємодії з хлорним залізом (3) α - токоферол окислюється до α -токоферилхінону - сполука червоного кольору.

Матеріали та реактиви. Спиртовий розчин (0.1 %) α -токоферолу, концентрована азотна кислота,1% розчин хлорного заліза (3).

Обладнання. Штатив із пробірками, крапельниця, піпетки.

Хід роботи.

1. Реакція з азотною кислотою.

В суху пробірку вносять пять краплин розчину вітаміну Є, додають 1 мл

концентрованої НNОз. Інтенсивно перемішують і спостерігають

поступову появу червоного забарвлення.

2. Реакція з хлорним залізом.

У суху пробірку вносять 0.5 мл спиртового розчину а-токоферолу, потім

0.5 мл рочину FеСІ₃ й інтенсивно перемішують. Спостерігають появу

червоного забарвлення.

Дослід 12.8 Якісна реакція на вітамін К.

Принцип методу. За наявності аніліну спиртовий розчин вітаміну К забарвлюється в

червоний колір, що зумовлено утворенням І-метил-2-

феніламінонафтохінону.

Хід роботи.

В пробірку з 1 мл спиртового розчину вікасолу додають дві краплини аніліну. Після перемішування вміст пробірки забарвлюється в червоний колір.

Питання і вправи до екперимептальної частини

1. Запропонуйте якісні реакції, за допомогою яких можна визначити тіамін?

2. Як довести наявність вітаміну В₂ у овочах?

3. Які якісні реакції ви можете запропонувати для виявлення вітаміну РР?

4. В чому поягає суть якісного визначення вітаміну В₆?

5. Запропонуйте якісні реакції на вітамін В₁₂?

6. Як проводять вилучення фолієвої кислоти з дріжджів?

7. В чому полягає суть якісної реакції на рутин?

8. Запропонуйте найбільш ефективний, на ваш погляд, метод якісного визначення вітаміну Д. Свій вибір обгрунтуйте.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 14

ТЕМА: Хроматографічне розділення суміші вітамінів. Кількісне визначення вітамінів.

Дослід 13.1 Розділення суміші водорозчинних вітамінів на пластинках Silufol

Принцип методу. Метод базується на здатності рідинної фази рухатися по шару адсорбента й за рахунок капілярної сили переміщувати з різними швидкостями компоненти суміші, яку розділяють. Положення плям речовин на хроматограммі характеризує значення Rf.

Матеріали та реактиви. Суміш вітамінів (тіамін, піридоксол, аскорбінова кислота, рибофлавин, нікотинова кислота) готується в 50% етанолі, розчинник №1 - бензол -метанол - оцтова кислота - ацетон (20: 20: 5: 5), розчинник №2 - бензол -метанол - оцтова кислота-ацетон (55: 35: 5: 5), пластинка Si1ufo1.

Обладнання. Мікропіпетки, джерело УФ-променів, камера для хромотографії.

Таблиця Rf водорозчинних вітамінів

Речовина	Розчинник №1	Розчинник №2
Тіамін	0,00	0,00
Піридоксол	0,17	0,60
Аскорбінова кислота	0,48	0,16
Рибофлавін	0,53	0,22
Нікотинова кислота	0,68	0,44

Хід роботи.

В кутку пластинки Silufol на відстані 2 см від кожного боку наносять розчин суміші вітамінів по 5 мкл, 3 мкг/мкл розчину тіаміну, аскорбінової та нікотинової кислот, 10 мкл 3 мкг\мкл розчину піридоксолу. Використовують двомірне розділення; для першого напрямку використовують розчинник №1. Потім пластинку пудсушують і проводять розділення в перпендікулярному напрямку в розчиннику №2. Потім пластинки висушують і виявляють плями вітамінів в ультрафіолетових променях, використовуючи значення Rf вітамінів для розчинників №1 і №2 (табл.)

Дослід 13.2 Кількісне визначення вітаміну Є.

Принцип методу. Під час взаємодії спиртового розчину α-токофсролу з концентрованою азотною кислотою суміш забарвлюється в червоний колір, інтенсивність якого пропорційна концентрації вітаміну Є й може бути визначена за допомогою фотоелектроколориметра.

Матеріали та реактиви. Спиртовий (0,1%) розчин вітаміну Є, 70% розчин азотної кислоти, абсолютний етиловий спирт.

Обладнання. Штатив із пробірками, колби, піпетки, водяна баня,

фотоелектроколориметр.

Хід роботи.

В дві пробірки наливають по 2,5 мл спиртового розчину вітаміну Є, додають по 0,5 мл розчину азотної кислоти й ставлять у киплячу водяну баню на 3 хв. Потім пробірки охолоджують і залишають у темному місці на 15 хв. Об'єм рідини в кожній пробірці доводять абсолютним еталоном до 5 мл, перемішують і фотометрують за λ 470 нм (синій світлофільтр). Концентрацію вітаміну Є в дослідному розчині визначають за калібрувальним графіком, де кожному значенню знайденої екстинкції відповідає певний вміст вітаміну Є в 1 мл розчину. Для побудови калібрувального графіка використовують спиртовий препарат, який містить в 1 мл 100 мг α-токоферолу. З цією метою 0,5 мл такого препарату розчинюють абсолютним еталоном у колбі об’ємом 50 мл (у 1 мл міститься 1 мг препарату). У чотири пробірки наливають по 0.5, 1.0, 1.5, 2,0 мл цього розчину й доводять загальний об’єм рідини абсолютним еталоном до 2.5 мл в кожній пробірці. За значенням оптичної густини розчинів, які мають різну кількість вітаміну Є, будують калібрувальний графік. На осі ординат відкладають екстинкції, на осі абсцис- відповідні концентрації вітаміну Є в 1 мл.

Дослід 13.3 Кількісне визначення вітаміну С.

Хід роботи.

Наважку порошку розтертого драже або таблеток, покритих оболонкою, з вмістом біля 0.1 г кислоти аскорбінової переносять водою у мірну колбу на 100 мл, доводять об’єм розчину до мітки, перемішують і фільтрують; перші 10 мл відкидають, 10 мл розчину вмішують в конічну колбу вмістимістю 100 мл, додають 1 мл 2% розчину хлористоводородної кислоти, 0.5 мл 1% розчину калія йодіда, 2 мл 0.5% розчину крохмалю, води до об’єма 20 мл і титрують розчином калія йодата (0.00167 моль\л) до появи стійкого світло-синього кольору.

Паралельно проводять контрольний дослід. Для цього в конічну колбу

вміщують 1 мл 2% розчину хлористоводородної кислоти, 0.5 мл 1% калія йодіда, 2мл 0.5% крохмалю, води до об’єму 20 мл і титрують розчином калія йодата (0.00167 моль\л) до появи стійкого світло-синього забарвлення.

1 мл розчину калія йодата (0.00167 моль\л) відповідає 0.0008806 г С₆Н₈O₆ (кислоти аскорбінової).