Питання і вправи до експериментальної частини

1. Чому додавання Na₂CO₃ до водної емульсії олії збільшують її стійкість?

2. В чому хімічна суть реакції жирів з суданом ІІІ?

3. Як визначають гліцерол у жирах? Приведіть хімізм процесу. Яку інформацію про якість жирів дає визначення в них гліцеролу?

4. Як можна виділити фосфоліпіди з біологічного матеріалу?

5. Як довести наявність фосфоліпідів в біологічних об'єктах?

6. В чому полягає суть реакції холінфосфоліпідів з хлоридом кадмію?

7. За допомогою яких реактивів можна довести наявність лецитину у біооб'єктах?

8. Як проводять проявлення пластинок SILUFOL при розділенні ліпідів методом ТШХ?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 8

Тема: Хімічні властивості компонентів нуклеїнових кислот.

Виділення і якісні реакції нуклеїнів.

Дослід 8.1. Мурексідна реакція на пуринові основи та похідні

пірімідіну

Принцип методу. Мурексидна проба на кофеїн (теобромін) основана на переході кофеїну під дією пероксиду водню та аміаку в мурексид, тобто амонійну сіль пурпурової кислоти:

Матеріали та реактиви. Кофеїн, теобромін, 2Н НС1,Н₂О₂ конц., NН₄ОН

Хід роботи.

а) 0,01-0,1 мг кофеїну або теоброміну вносять у фарфорову чашку, прибавляють 10 крапель розведеної соляної кислоти і 10 крапель пероксиду водню і випарюють на водяній бані досуха. Чашку охолоджують, до утворенного осаду додають декілька крапель аміаку. З'являється пурпурно-червоне забарвлення.

б) Декілька мг кофеїну, теоброміну чи сечової кислоти внесіть в маленьку фарфорову чашку і додають 1-2 краплі азотної кислоти (концентрованої). Суміш випарюють насухо на водяній бані. Якщо до залишку додати аміак, то внаслідок утворення мурексиду з'являється інтенсивний червоно-фіолетовий колір, який під дією їдкого натру перейде в синій.

Дослід 8.2. Реакція пуринів з таніном

Принцип методу похідних пурину крім мочевої кислоти відносяться різні алкалоїди, наприклад, кофеїн, теобромін, теофілін. По своїй будові кофеїн це 1,3,7-триметил-2, 6-диоксипурин, або 1,3,7-триметилксантин.Він знаходиться головним чином у чаї (2-4%) і в зернах кави (1,5%), звідки його добувають. Чистий кофеїн кристалізується з однією молекулою води у вигляді довгих шовковистих голок, розчинених у воді. Як і більшість алкалоїдів, кофеїн осаджується з розчинів таніном.

Матеріали та реактиви. Чай сухий, насичений розчин таніну.

Хід роботи.

На скло або чашку Петрі кладуть 1 г сухого чаю, накривають другим склом і на невеликому полум'ї нагрівають. Спочатку з'являються пари води, потім возгоняється кофеїн, який осаджується у вигляді кристалів на верхньому склі. Кристали розчиняють в декількох мілілітрах води, фільтрують і до фільтрату додають декілька крапель насиченого розчину таніну. При цьому випадає білий осад.

Дослід 8.3 Добування нуклеопротеіда з дріжджів і реакція їх з молібдатом амонію

Принцип методу. Метод грунтується на взаємодії фосфорної кислоти з молібденовим реактивом із утворенням забарвленої сполуки - фосфорної солі молібдату амонію:

12 (NH₄)₂ M₀O₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃

21NH₄NO₃ + (NH₄)₃PO₄ · 12M₀O₃ · 6H₂O + 6H₂O

Хід роботи.

Гідролізат нулеопротеідів дріжджів готують таким чином. У колбу з круглим дном для гідролізу вміщують 1 г пекарських дріжджів, доливають 20 мл 10%-го розчину сірчаної кислоти та 20 мл дистильованої води, колбу закривають пробкою, в яку вставляють скляну трубку (як холодильник) довжиною 20-30 см, кип'ятять тягою протягом 1 год на азбестовій сітці при слабкому нагріванні. Після закінчення гідролізу рідину охолоджують, додають води до одержання початкового об'єму й фільтрують. До 1мл гідролізату додають 1 мл молібденового реактиву та кип'ятять. Рідина забарвлюється в лимонно-жовтий колір, а внаслідок охолодження випадає кристалічний осад жовтого кольору, який зумовлений фосфорномолібденовокислим амонієм.

Дослід 8.4. Якісна реакція на пуринові основи з АgNO₃

Принцип методу. Метод грунтується на утворенні комплексів пуринових основ із солями срібла.

Матеріали та реактиви. Концентрований розчин аміаку;

1%-й розчин АgNO₃, дріжджі.

Хід роботи

До 1 мл гідролізату додають концентрований розчин аміаку до одержання лужного середовища (за лакмусом) і 0,5 мл розчину АgNO₃ Через 3-5 хв. утворюється пухкий осад срібних солей пуринових основ.

Дослід 8.5. Виявлення простих білків у складі нуклеопротеїдів.

Принцип методу. Для підтвердження наявності білків у складі нуклеопротеідів використовують біуретову реакцію/ Ця реакція характерна для сполук, які містять не менш двох пептидних зв'язків. Такі полімери (білки) в лужному середовищі утворюють із сульфатом міді забарвлені комплексні сполуки, колір яких залежить від довжини поліпетидного ланцюга. Розчин нативного білка має синьо-фіолетове забарвлення, а продукти його гідролізу (пептиди) - червоно-фіолетове.

Матеріали та реактиви. Гідролізат нуклеопротеїдів дріжджів (спосіб виготовлення дивися дослід №3), 10%-й розчин гідроксиду натрію, 1%-й розчин сульфату міді.

Обладнання. Пробірки, піпетки, крапельниці.

Хід роботи.

У пробірку вносять 0,5 мл гідролізату, нейтралізують (за лакмусом) розчином NаОН, потім додають 0,5 мл розчину NаОН і дві-три краплі розвину СuSO₄, перемішують і спостерігають появу забарвлення, що свідчить про наявність у пробі поліпептидів, які утворюються внаслідок гідролізу, білкової частини нуклеопротеідів.

Дослід 8.6. Виділення рибонуклеопротеідів.

Принцип методу. Рибонуклеопротеіди розчиняються в лужних розчинах і можуть бути осаджені в ізоелектричній точці шляхом додавання органічних кислот (наприклад, оцтової кислоти).

Матеріали та реактиви. Сухі дріжджі; 0,4%-й та 0,02 моль/л розчин NаОН, 5%-й розчин оцтової кислоти; фільтри.

Обладнання. Фарфорова ступка з товкачиком, скляні палички, центрифужні та звичайні пробірки, лійки, центрифуга.

Хід роботи.

Для одержання рибонуклеопротеідів наважку (10г сухих дріжджів) старанно розтирають у фарфоровій ступці протягом 10 хв. із 50мл 0,4%-го розчину їдкого натрію, який додають, невеликими порціями. Центрифугують 10 хв 2000 обертів. Осад відділяють, до центифугату доливають, помішуючи, 15-20 мл розчину оцтової кислоти. Осад, який випадає, відокремлюють центрифугуванням. Після центрифугування осад розчиняють у 15-20 мл розчину лугу (0,02 моль/л). Одержані розчини нуклеоиротеідів використовують у якісних реакціях.

Дослід 8.7. Реакція на вуглеводний компонент з дифе ніламіном

Принцип реакції. Нуклеопротеїди, на відміну від простих білків, вступають у специфічну кольорову реакції) з деякими речовинами, що дозволяє визначити вуглеводний компонент у складі їх молекул. Так, нуклеопротеїди, які містять рибозу, дають з орциновим реактивом синьо-зелене забарвлення; для дезоксирибонуклеопротеїдів характерні кольорові реакції з дифеніламіном, індолом, фуксинсірчаною кислотою.

Хід хоботи.

У пробірці 2мл розчину рибонуклеопротеіду нагрівають з рівним об'ємом дифеніламінового реактиву. Суміш забарвлюється в зелений колір.

Дослід 8.8. Якісне визначення ДНК за методом Діше.

Метод грунтується на здатності вуглеводного компоненту нуклеїнових кислот (рибози та дезоксирибози) вступити в специфічні кольрові реакції з солянокислим цистеїном.

Матеріали та реактиви. 0,01-0,1%-й водяний розчин натрієвої солі ДНК, 5 %-й розчин солянокислого цистеїну, розчин сірчаної кислоти (6 мл води та 15 мл концентрованої Н₂SO₄).

Обладнання. Пробірки, піпетки, мікропіпетки, водяна баня.

Хід робот.

До 1 мл розчину ДНК додають 0,04 мл розчину солянокислого цистеїну та 5 мл розчину сірчаної кислоти. Суміш нагрівають на водяній бані за Т 40 С протягом 5 хв. Розчин забарвлюється в рожевий колір, який не зникає протягом кількох годин.

Питання до теоретичної частини.

І. Що собою являють нуклеїнові кислоти ? Яке їх біологічне зна­чення?

2. Які основи і вуглеводи входять до складу ДНК іРНК?

3. Які види таутомерії характерні для аденіну, гуаніну, цитозину? 4.Відомо,що рибоза і дезоксірибоза володіють відновними властивостями. Поясніть, чому РНК і ДНК, до складу яких входять ці вуг­леводи, не являються редуцюючими?

5.З яких компонентів складаються молекули аденозину і цитидіну? Напишіть хімічні формули цих нуклеозидів.

6. Чим відрізняється хімічна будова молекул нуклеотидів від нуклеозидів?

7. Яке фізіологічне значення нуклеотидів?

8. Наведіть схему утворення нуклеотидів.

9.В чому полягає суть біосинтезу пуринових та пірімідінових нук­леотидів?

10. Дайте характеристику тримірної структури ДНК.

11. Відомо, що такі гетероцикли як піримідін, аденін, цитозин проявляють основні властивості. Чому ДНК, до складу яких вхо­дять ці гетероцикли, являються сильною багатоосновною кисло­тою?

12. Чому ДНК і РНК поглинають в УФ-частини спектра?

ІЗ. Назвіть три типи РНК. Які функції кожного з них?

14.Наведіть схему катаболізму пуринів і піримідінів.

Питання до експериментальної частини

І. За допомогою яких реакцій можна виявити пуринові основи? На­ведіть схеми реакцій, які лежать в основі методів ідентифікації пуринів.

2. Як визначають вуглеводний компонент у нуклепротеїдах?

3. Приведіть загальну структурну формулу нуклеопротеїдів.

4. Як виділяють нуклеопротеїди з дріжджів?

5. Як довести наявність нуклеопротеїдів у біологічних зразках?

6. Як визначають наявність білків у складі нуклеопротеїдів?

7. Запропонуйте метод визначення Н₃Р0₄ у складі нуклеопротеїдів.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 9

Тема: Виділення та очистка білків

Принцип реакції. Порушення факторів, які стабілізують структуру молекули білка, призводять до осадження білків. Так, внаслідок кип'ятіння порушуються зв'язки у молекулі нативного білка. Кращий спосіб осадження білків - кип'ятіння в середовищах, які мають рН, що дорівнює ізоелекричній точці білків. Внесення в розчин білку нейтральних солей (сульфату амонію, хлориду натрію тощо) полегшує та прискорює осадження під час кип'ятіння внаслідок дегідратування білкових часток.

Мінеральні та деякі органічні кислоти, органічні розчинники осаджують білки в результаті денатурації та дегідрації білкових молекул, а також внаслідок утворення комплексних солей білків із кислотами.

Солі важких металів (міді, ртуті, срібла, свинцю) осаджують білки в результаті утворення комплексних сполук із сульфідрильними групами білків. Осад білка в надлишку солей деяких важких металів (ацетату свинцю, сульфату міді) розчиняється. Це пов'язано з тим, що надлишок іонів цих металів адсорбуючись на поверхні білкових часток, викликає перезарядку білкового комплесу, внаслідок чого він переходить у розчин.

У водному розчині більшість білків та їх часток (міцел) заряджені й гідровані, що зумовлює осадження білків у розчинах. Але за високої концентрації середніх солей (сульфату амонію, хлориду натрію), молекули яких у водних розчинах гідровані, руйнуються водні оболонки білкових молекул, у результаті чого знижується електричний заряд білкової молекули іонами солі, які адсорбуються на ній, частки білка злипаються одна з одною, укрупнюються та випадають в осад.

Дослід 9.1. Осадження білків нагріванням.

У пробірку вносять 2 мл розчину яєчного білка й нагрівають на киплячій водяній бані. Спостерігають утворення осаду (згортання білка).

Щоб порівняти залежність осадження білків від концентрації водневих іонів, у п'ять пробірок додають по 5 мл розчину яєчного білка. Нейтральний розчин білка у першій пробірці нагрівають до кип'ятіння, він мутнішає, спостерігається опалесценція, що зумовлена руйнуванням гідратної оболонки довколо молекули білка та збільшенням білкових часток. Але міцели білка заряджені й тому залишаються у розчині, не випадаючи в осад. Розчин у другій пробірці нагрівають до кип'ятіння, вливають один мл розчину оцтової кислоти до появи слабокислої реакції. Внаслідок відстоювання білок випадає в осад. За цих умов частки білка втрачають заряд, тому що рН середовища близька до ізоелектричного стану.

В третю пробірку вносять 3 мл розчину оцтової кислоти для створення кислої реакції середовища. Під час кип'ятіння розчину осад не утворюється, оскільки молекули білка набувають позитивного заряду, що підвищує їх стійкість.

У четверту пробірку вносять 5 мл розчину оцтової кислоти, 2мл насиченого розчину хлориду натрію та нагрівають. Випадає білий осад. Його утворення викликано тим, що білок внаслідок взаємодії з іонами хлориду натрію втрачає свій заряд.

У п'яту пробірку вносять 2 мл. розчину гідроксиду натрію для створення лужного середовища. Під час кип'ятіння рідини осад не утворюється, оскільки у лужному середовищі збільшується від'ємний заряд білка.

Дослід 9.2. Висолювання білків.

До розчину яєчного білка додають насичений розчин сульфату амонію. Спостерігають помутніння й випадіння осаду. При додаванні води осад білка знову розчиняється.

Дослід 9.3. Осадження білків іонами важких металів.

У дві пробірки додають по 3 мл розчину яєчного білка. В першу - 2-3 краплі розчину сульфату міді, в другу - 2-3 крапллі розчину ацетату свинцю. Спостерігають утворення осаду (з сіллю міді - блакитного кольору, свинцю - білого). Внаслідок додавання надлишку розчинів сульфату міді та ацетату свинцю осад, що утворився, розчиняється.

Дослід 9.4. Осадження білків мінеральними та органічними кислотами.

В пробірку вносять 3 мл. концетрованої азотної кислоти. Потім по стінці пробірки обережно, щоб рідини не перемішувалися, додають 3 мл. розчину яєчного білка. На межі поділу двох рідин утворюється осад у вигляді білкового кільця (проба Гелера). Вміст перемішують, доливають надлишок азотної кислоти й пересвідчуються що осад не зникає.

В пробірку вносять 5 мл. розчину яєчного білка. Додають 1 мл. розчину сульфосаліцилової кислоти. Спостерігають випадіння осаду білку.

Дослід 9.5. Осадження білків органічними розчинниками.

В дві пробірки вносять по 3 мл розчину яєчного білку. Потім у першу додають 3 мл етилового спиту, в другу - ацетону. Розчини в обох пробірках мутнішають. Якщо до них додати по 1 мл насиченого розчину хлориду натрію, через деякий час білок випадає у осад.

Дослід 9.6. Осадження білків реактивами на алкалоїди.

В три пробірки вносять по 1 мл розчину яєчного білку, по 0,5 мл. розчину оцтової кислоти й по 2-3 краплини таких речовин: в першу -розчину пікринової кислоти, в другу - насичений розчин таніну, в третю - розчину гексаціано — (II) — ферату калію. Спостерігають випадіння осаду. Після додавання надлишку розчину гексаціано - (II) - ферату калію та розчину таніну осад розчиняється.

Дослід 9.7. Визначення окремих амінокислот хроматографічним методом.

Метод розподільчої (радіальної) хроматографії на папері.

Принцип методу. Метод розподільчої хроматографії для розділення амінокислот на папері грунтується на відмінності коефіцієнтів розподілу окремих амінокислот між двома рідинами, що не змішуються. Хроматографічний папір, який використовується як інертний носій, може утримувати у порах велику кількість нерухомої рідкої фази.

Коефіцієнт розподілу Rf, який визначається як співвідношення відстаней, що пройшли амінокислота та рухома фаза від точки старту, є характерною величиною для кожної амінокислоти за певних умов дослідів (склад розчинника, температура, сорт хроматографічного паперу).

Положення амінокислот на папері визначають за допомогою кольорової реакції з нінгідрином. За наявності нінгідрину окремі амінокислоти виявляються у вигляді плям, забарвлених у блакитний, фіолетовий, жовтий чи інший колір (залежно від хімічної структури амінокислоти).

Амінокислоти у суміші ідентифікують за допомогою відомих амінокислот (стандартів).

Матеріали та методи. Хроматографічний папір, розчинник - суміш н-бутанолу, оцтової кислоти, води (4:1:1), суміш амінокислот та їх стандартні розчини (0,1% -розчину аланініну, лейцину та глутамінової кислоти), свіжовиготовлений нінгідриновий реактив (95 мл 0,5% - го розчину нінгідрину у 95% - му ацетоні, 1 мл льодяної оцтової кислоти та 4 мл дистильованої води).

Обладнання. Ексикатор чи чашка Петрі, пульверизатор, мікропіпетки, сушильна шафа, олівець, лінійка, годинник.

Хід роботи.

Хроматографічний папір вирізають у формі кола, діаметр якого дорівнює діаметру ексикатора чи чашки Петрі. Простим олівцем коло поділяють на сегменти, в центрі роблять невеликий отвір (0,5 - 1 см.), у який вставляють згорнутий у трубочку фільтрувальний папір (гніт). Змінюючи товщину та довжину ґноту, зануреного у розчинник, регулюють швидкість поширення розчинника на хроматорафічному папері.

Олівцем біля основи ґноту на хроматографічному папері в кожному сегменті позначають точку нанесення амінокислот. На один із сегментів за допомогою мікропіпетки наносять суміш амінокислот (5 -10 мкл аланіну, лейцину та глутамінової кислоти), на інший - таку ж кількість амінокислот стандартів. Потім хроматографічний папір висушують на повітрі протягом 10 хв. У ексикатор наливають розчинник - суміш н-бутанолу, оцтової кислоти та води (4:1:1) у такому об'ємі, щоб гніт був занурений у розчинник.

Колову хроматограму розташовують у ексикаторі. Хроматограма діаметром 12 см утворюється через 1 год., діаметром 20 см. - через 2 год. Після завершення розподілу (фронт розчинника дійшов до встановленої відмітки) хроматограму висушують й проявляють, обприскуючи нінгідриновим реактивом із пульверизатора та прогріваючи у сушильній шафі протягом 10 хв. за температури 110° С.

Амінокислоти ідентифікують, порівнюючи положення плям суміші амінокислот і амінокислот - стандартів. За допомогою лінійки визначають відстані, пройдені розчинником та амінокислотами, й розраховують значення коефіцієнту розподілу.

ПИТАННЯ ТА ВПРАВИ

До теоретичної частини:

1. З яких амінокислот (альфа, бета, гамма) складаються молекули білків?

2. Як досліджують амінокислотний склад білків?

3. Амінокислоти відомі як амфотерні сполуки. Чому розчин лізину володіє лужною реакцією, а розчин глутамінової кислоти - кислотною?

4. Які хімічні зв'язки характерні для білкової молекули ?

5. Напишіть структурні формули відомих вам незамінних амінокислот. Яка їх особливість ?

6. Напішить схему біосинтезу білків.

7. Охарактеризуйте різні організації білків

8. Охарактеризуйте методи виділення й очистки білків.

9. Охарактеризуйте механізм денатурації білків.

10. Які якісні реакції використовуються для ідентифікації білків? У чому їх суть?

11. Які структурні компоненти біологічних мембран?

12. Де використовуються штучні моделі мембран ?

13. Розкажіть про знаходження білків у природі.

До експериментальної частини:

1. Як можна осадити білки ?

2. Як проводять висолювання білків ?

3. В чому суть висадження білків важкими металами, мінеральними кислотами, органічними розчинниками, алкалоїдами, реактивами на алкалоїди ?

4. Які реактиви на алкалоїди використовуються для осадження білків ?

5. Як проводять визначення окремих амінокислот ?

6. Які реактиви використовують для проявлення хроматографічного паперу при визначенні амінокислот ?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 10

ТЕМА: Вивчення властивостей білків і їх визначення.

Дослід 10.1 Визначення ізоелектричної точки білків.

Принцип методу.

Визначення ізоелектричної точки білків грунтується на здатності

білків легко осаджуватися під дією осаджувачів, які спричинюють

дегідратацію білків, і за значення рН середовища, що відповідає їх

ізоелектричній точці. Розчин казеїну та желатину (1%), 0.01, 0.1 і 1

моль\л розчини оцтової

кислоти, 0.1 моль\л розчин ацетату натрію, 96% етиловий спирт (чи 95%

ацетон), дистильована вода.

Обладнання.

Скляні палички, пробірки, градуйовані піпетки, штатив для пробірок.

Визначення ізоелектричної точки казеїну.

На відміну від інших білків, казеїн осаджується в ізоелектричній точці

без дегідратуючих засобів. Ізоелектрична точка казеїну відповідає

рН 4,7.

Таблиця 2.

Співвідношення компонентів реакційної суміші (мл) для визначення ізоелектричної точки казеїну.

вода	СН3СООН (0.01 моль/л)	СН3СООН (0.1 моль/л)	Розчин казеіну (1%)	рН середовища
8,4	0,6		1,0	5,9
7,8	1,3		1,0	5,6
8,8		0,3	1,0	5,3
8,5		0,5	1,0	5,0
8,0		1,0	1,0	4,7
7,0		2,0	1,0	4,4
8,0		4,0	1,0	4,1
1,0		8,0	1,0	3,8

Хід роботи.

Беруть вісім пробірок. У кожну наливають воду, розчини оцтової кислоти та казеїну в співвідношеннях, які наведені в таблиці 2. Ізоелектричну точку казеїну визначають за максимальним ступенем помутніння (рН 4.7).

Визначення ізоелектричиої точки желатину.

Хід роботи.

В шість пробірок додають відповідну кількість (мл) розчинів оцтової кислоти, ацетату натрію, дистильованої води та желатину (табл 3). Вміст кожної пробірки перемішують. Потім у всі пробірки повільно по стінці доливають по 2 мл спирту (ацетон). Через ЗО хв визначають ізоелектричну точку, тобто знаходять пробірку з максимальним ступенем помутніння розчину.

Таблиця 3.

Співвідношення компонентів реакційної суміші (мл) для визначення ізоелектричної точки желатину.

Вода	СН3СООН (0,1 моль)	СН3СООН (1моль/л)	СН3СООНNа 0,1моль/л	Розчину желатину (1%)	рН середовища
3,8	0,8		2,0	2,0	5,6
3,5	0,5		2,0	2,0	5,3
3,0	1,0		2,0	2,0	5,0
2,0	2,0		2,0	2,0	4,7
	4,0		2,0	2,0	4,4
3,8		0,8	2,0	2,0	4,1

Дослід 10.2 Якісна реакція на пептидні зв'язки з нінгідрином.

Принцип методу.В результаті взємодії -амінокислоти з нінгідрином (трикетогідринденгідратом) утворюється забарвлена комплексна сполука. Під час нагрівання (до температури 70° С) -амінокислоти окислюються нінгідрином та піддаються окисному дезамінуванню з утворенням альдегіду і С0₂, а нінгідрин відновлюється:

Відновлений нінгідрин, що конденсується з аміаком і окисленим нінгідрином, утворює сполуку, яка, енолізуючись, переходить у забарвлену форму синьо-фіолетового кольору:

За наявності органічних розчинників, на яких готують розчин нінгідрину (ацетон, етанол), можливий перебіг побічної реакції з утворенням сполуки, яка містить радикал (R.) амінокислоти:

Наявність радикалу амінокислоти в складі цієї сполуки зумовлює різне забарвлення (червоне, жовте, блакитне) сполук, які утворюються під час реакції амінокислот із нінгідрином.

Реакція з нінгідрином є специфічною для амінокислот, що містять

-аміногрупу, та характерною для деяких карбонових і циклічних амінокислот. У реакції гліцину з нінгідрином утворюється комплексна сполука синьо-фіолетового забарвлення

.

А. Хід роботи.