Передмова

Практикум є складовою частиною навчального ком­плексу з курсу «Біохімія». Він містить методичні вказів­ки до проведення лабораторних занять студентами.

Основна мета практикуму — закріплення теоретичних знань шляхом формування практичних навиків у галу­зях статичної, динамічної та функціональної біохімії. Під час виконання запропонованих робіт студенти опа­новують сучасні методи експериментальних досліджень, набувають уміння аналізувати одержані результати.

До практикуму ввійшли найтиповіші лабораторні ро­боти з основних розділів біохімії: вуглеводи, ліпіди, нук­леїнові кислоти, білки, ферменти, вітаміни та гормони. В кожному розділі роботи наведені за збільшенням складності з урахуванням набутих у процесі навчання знань. Спочатку вивчаються загальні та специфічні фізико-хімічні властивості біологічно активних речовин, по­тім методи виділення з біологічного матеріалу та вста­новлення їх функціональної ролі.

У лабораторних роботах викладено принцип методу, наведено структурні формули та реакції речовин, які взаємодіють, перелік основних матеріалів, реактивів і обладнання, докладний опис ходу роботи й очікуваних результатів. Така побудова робіт дозволяє проводити їх без додаткових вказівок, що має важливе значення для підготовки студентів до самостійного виконання науко­вих робіт.

Лабораторна робота № 1 Тема: Мінеральні речовини.

Дослід 1.1. Якісне визначення мінеральних речовин

Принцип методу. До складу всіх клітин і тканин організму вхо­дять вуглець, кисень, водень і азот, які утворюють основну масу органічної речовини. Проте в організмі е також сірка, хлор, фос­фор, натрій, калій, магній, залізо та інші елементи, які містяться в органічних і неорганічних сполуках. Для їх виявлення дослі­джувану тканину мінералізують спочатку до утворення вуглепо­дібного залишку, а потім до повного озолення.

Якісне визначення мінеральних речовин засноване на їх взає­модії з певними сполуками, продукти реакції яких можуть вияв­лятися у вигляді характерних осадів або забарвлених розчинів.

Матеріали та реактиви. М'язи, кров або молоко; 20 %-й роз­чин винної кислоти; 10 %-й розчин гідропіроантимонату калію; 5 %-й та 10 %-й розчини азотної кислоти; 2 %-й розчин азотнокис­лого срібла; 10 %-й розчин роданіду калію або амонію; 5 %-й роз­чин гексаціано-(П)-ферату калію; концентрований та 4 %-й роз­чини аміаку; 5 %-й розчин і льодяна оцтова кислота; 4 %-й розчин оксалату амонію [(NН₄)2С₂О₄]; насичений розчин молібдату амо­нію; магнезіальна суміш - 10 г МgС1₂, 14 г NН₄С1 та 25 мл NН₄ОН розчиняють у 175 мл води; 1 %-й розчин пероксиду водню; 1 %-й розчин гваякола; 0,5 %-й розчин соляної кислоти; фільтри папе­рові.

Обладнання. Штатив із пробірками, піпетки, крапельниці, га­зовий пальник, фарфорова ступка.

Хід роботи. А. Досліджуваний матеріал (5 г) нагрівають у тиг­лі на полум'ї газового пальника до утворення вуглеподібної маси та припинення виділення диму. Після охолодження тигля утворену масу кілька разів екстрагують невеликими порціями гарячої води. Водні витяжки фільтрують через фільтрувальний папір. Фільтрат використовують для таких реакцій:

а) виявлення іонів К⁺ — до 0,5 мл фільтрату додають кілька краплин розчину винної кислоти; утворюється кислий виннокислий калій (білий кристалічний осад)

КС1 + С₄Н₆О₆  С₄Н₅О₆ + НС1;

б) виявлення іонів Na⁺ - до 0,5 мл водної витяжки мінералізату додають кілька краплин розчину гідропіроантимонату калію; при цьому утворюється білий кристалічний осад гідропіроантимо­нату натрію

2NаСI + К₂Н₂Sb₂О₇ + Nа₂Н₂Sb₂O₇ + 2КС1;

в) виявлення іонів С1^- - до 0,5 мл фільтрату, підкисленого кіль­кома краплинами 10 %-го розчину азотної кислоти, додають крап­линами розчин азотнокислого срібла; при цьому утворюється білий осад хлориду срібла

НС1 + АgNOз  АgСІ + НNО₃.

Б. Немінералізовану тканину, що залишилася на фільтрі після екстрагування водою, висушують і прокалюють у тиглі до повного озолення. Золу розчиняють у 5 мл розчину соляної кислоти; розчин фільтрують. У фільтраті виявляють фосфати кальцію та магнію, а також солі заліза (III). Фільтрат використовують для таких ре­акцій:

а) виявлення іонів Ре³⁺, І спосіб - до 0,5 мл солянокислого розчину золи додають кілька краплин розчину роданіду калію; при цьому утворюється роданід заліза (III), і виникає червоне за­барвлення

FеСІ₃ + 3КСNS  Fе(СNS)з + ЗКС1;

II спосіб - до 0,5 мл солянокислого розчину золи додають роз­чин жовтої кров'яної солі (К₄[Fе(СN)₆]) до появи синього забарв­лення; утворюється гексаціано-(ІІ)-ферат заліза

4FеС1з + ЗК₄[Fе(СN)₆]  Fе₄[Fе(СN)₆]₃ + 12КС1;

б) виявлення іонів Мg²+, Са²⁺ та РО³ — зазначені іони утво­рюються під час нейтралізації 40 мл солянокислого розчину золи 4%-м розчином аміаку до появи ледь помітної каламуті, потім до­дають розчин оцтової кислоти до розчинення утвореної каламуті; із цього оцтовокислого розчину у вигляді осаду можна одержати кальцій, додаючи розчин оксалату амонію

СаС1₂ + (NH₄)₂С₂О₄ СаС₂О₄ + 2NН₄С1;

осад оксалату кальцію СаС₂О₄ відфільтровують, і з фільтра, куди заздалегідь вносять концентрований аміак, осаджують магній у вигляді фосфорноамонійномагнієвої солі (білий кристалічний осад)

МgНРО₄ + NН₄ОН  МgNН₄РО4 + Н₂О;

одержаний осад відфільтровують, до фільтрату додають магнезі­альну суміш; при цьому осаджується фосфорна кислота

(NН₄)₂НРО₄ + МgSО₄ + NН₃  МgNН₄РО₄  + (NН₄)₂SО₄;

для виявлення фосфорної кислоти використовують обидва осади фосфорноамонійномагнієвої солі, їх злегка промивають водою й розчиняють на фільтрі в 20 мл 5 %-ї азотної кислоти. Утворений розчин нагрівають у 5 - 10 мл насиченого розчину молібдату амо­нію; при цьому випадає жовтий осад фосфорномолібденовокислого амонію:

Н₃РО₄ + 12(NН₄)₂МоО₄ +21HNO₃ 

(NН₄)₃РО₄12МоО₃ + 21NН₄NОз + 12Н₂О.

В. Виявлення іонів Сu²⁺. До 10 г досліджуваного матеріалу у фарфоровій ступці додають 1 мл розчину пероксиду водню та 2 мл льодяної оцтової кислоти, старанно гомогенізують і залишають на 10 хв. Потім додають 1 мл розчину роданіду калію або амонію та 1 мл розчину гваякола. За зміною забарвлення визначають наяв­ність міді. Якщо суміш набуває синьо-зеленого кольору, це свід­чить про наявність слідів міді, якщо інтенсивного синього - то мідь міститься в значній кількості.

Дослід 1.2. КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ МІНЕРАЛЬНИХ РЕЧОВИН

1. Визначення хлоридів у сечі за методом Мора

Принцип методу. Хлориди осаджуються титрованим розчином азотнокислого срібла за наявності індикатора хромовокислого ка­лію, який реагує з азотнокислим сріблом після осадження всього хлору сечі й утворює з сріблом осад оранжево-червоного кольору. Реакція відбувається за рівняннями:

NaCI + AgNO₃AgCINaNO₃;

2AgNO₃+K₂CrO₄Ag₂CrO₄+2KNO₃

Кількість азотнокислого срібла, витраченого під час титрування на утворення осаду хлориду срібла, еквівалентна кількості хлору.

Матеріали та реактиви. Сеча; 5 %-й розчин хромовокислого ка­лію; розчин азотнокислого срібла (0,1 моль/л).

Обладнання. Колби об'ємом 50 мл, піпетки, крапельниці, бю­ретки.

Хід роботи. В одну колбу (дослід) наливають 1 мл сечі, яка не повинна містити білків і вуглеводів, і 5 мл дистильованої води, у другу

(контроль) – 6 мл води. В обидві колби додають по три краплини розчину хромовокислого калію (індикатор) і титрують розчином азотнокислого срібла. Випадає білий осад хлориду сріб­ла. Титрування продовжують до утворення оранжево-червоного осаду.

Зазначимо, що 1 мл розчину азотнокислого срібла (0,1 моль/л) відповідає

3,55 мл хлору або 5,85 мл хлориду натрію (молекуляр­на маса хлору дорівнює 35,5, а хлориду натрію — 58,5).

Кількість хлоридів (хлориду натрію), г, у 1 л сечі розрахову­ють за формулою:

С= (А — В) f 3,55(5,85) 1000/1000,

де А - В - різниця результатів титрування досліджуваного та кон­трольного зразків у 1 мл 0,1 моль/л розчину азотнокислого срібла; f - коефіцієнт поправки на 0,1 моль/л розчин азотнокислого срібла.

2.Визначення кальцію молока за методом де Ваарда

Принцип методу. Сполуки кальцію становлять близько 1/5 за­гальної кількості мінеральних речовин молока (в коров'ячому мо­лоці— 140 %, молоці жінки, що годує немовля,— 34 %). У сиро­ватці крові їх міститься 10 %.

Кальцій осаджується щавлевокислим амонієм. Утворений осад щавлевокислої солі розчиняють у сірчаній кислоті, при цьому ви­вільняється еквівалентна кількість щавлевої кислоти, яку відтитровують марганцевокислим калієм. Реакція відбувається у та­кій послідовності:

Кількість марганцевокислого калію, витраченого на титруван­ня, еквівалентна вмісту кальцію в молоці.

Матеріали та реактиви. Розведене водою молоко (10 : 1), 4 %-й розчин щавлевокислого амонію, 2 %-й розчин аміаку, 1 моль/л розчин сірчаної кислоти, 0,01 моль/л розчин марганцевокислого калію.

Обладнання. Центрифуга, водяна баня, пробірки, бюретки, пі­петки, скляні палички.

Хід роботи. В одну центрифужну пробірку піпетками наливають 1 мл розведеного молока, у другу - 1 мл води. В обидві про­бірки доливають по 0,5 мл розчину щавлевокислого амонію, пере­мішують скляною паличкою та залишають на ЗО хв, після чого центрифугують (10-15 хв за 600g). Прозору рідину над осадом обережно виливають, а в обидві пробірки з осадом додають по 4 мл розчину аміаку й знову центрифугують (10 хв за 600g). Піс­ля старанного видалення надосадової рідини до осадів обох про­бірок додають по 1 мл розчину сірчаної кислоти. Скляними палич­ками вміст пробірок розмішують до повного розчинення осаду й ставлять на 5 хв (з паличками) на гарячу водяну баню. Гарячі роз­чини титрують розчином марганцевокислого калію, безперервно помішуючи паличками, до появи блідо-рожевого забарвлення, яке зберігається протягом 1 хв.

Зазначимо, що 1 мл 0,01 моль/л розчину КМпС>4 відповідає 0,2 мг кальцію. Кількість кальцію в молоці, %, обчислюють за формулою:

С = 0,2 (Л —В) 100/0,1,

де А-В - різниця результатів титрування досліджуваного та кон­трольного зразків у 1 мл 0,01 моль/л розчину КМпО₄, 0,1 - вміст молока, мл, у 1 мл молочного розчину.

3. Визначення міді в сироватці крові за методом Шмідта.

Принцип методу. Під час взаємодії міді з комплексоутворювачем з'являється жовте забарвлення, інтенсивність якого пропор­ційна концентрації міді. Концентрація міді в сироватці крові лю­дини становить 70-150 %

(15-25 мкмоль/л); вона входить в ос­новному до складу церулоплазміну

(а₂-глобуліни) й у невеликій кількості перебуває у вільному стані.

Матеріали та реактиви. Сироватка крові; 20 %-й розчин трихлороцтової кислоти; 4 %-й розчин пірофосфату натрію (На4?2О7); концентрований

(25 %-й) розчин аміаку; 1 %-й розчин диетилдітіокарбомату натрію.

Обладнання. Центрифуга, фотоелектроколориметр, колби об'є­мом 50 мл, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В одну центрифужну пробірку наливають 2 мл си­роватки крові, в другу—2 мл дистильованої води (контроль). В обидві пробірки додають по 5 мл води, 3 мл розчину трихлороц­тової кислоти, перемішують і через 10 хв центрифугують (30хв за 1000g). Одержану прозору надосадову рідину обережно деканту-ють. До 5 мл цієї рідини доливають 1 мл розчину пірофосфату нат­рію, 0,5 мл розчину аміаку; 1 мл розчину диетилдитіокарбомату натрію й струшують протягом 15-20 с. Такі ж реактиви додають і в контрольну пробірку.

Інтенсивність забарвлення визначають на фотоелектроколориметрі, використовуючи синій світлофільтр.

Вміст міді в сироватці крові, %, обчислюють за такою форму­лою:

С -Сдосл/^СТ»

де E_досл — екстинкція досліджуваної проби; Е_ст — екстинкція стандартного розчину.

4. Визначення неорганічного фосфору м'язової тканини

Принцип методу. Метод заснований на здатності неорганічного фосфору, який можна виявити в безбілковому екстракті м'язової тканини, утворювати з розчином молібдату амонію в кислому середовищі амонійну сіль фосфорномолібденової кислоти - (МН₄)зРО₄- 12МоОз-6Н₂О. Ця кислота внаслідок відновлення ас­корбіновою кислотою, гідрохіноном тощо перетворюється на фос-форномолібденову синь, інтенсивність забарвлення якої пропорцій­на вмісту фосфору в досліджуваному матеріалі.

Матеріали та реактиви. М'язи; 10 %-й розчин трихлороцтової кислоти; 0,1 %-й розчин аскорбінової кислоти; розчин молібдату амонію (0,5 г чистого молібдату амонію розчиняють у 100 мл во­ди, фільтрують, змішують із 100 мл 10 моль/л розчину сірчаної кислоти).

Обладнання. Центрифуга, фотоелектроколориметр, колби об'є­мом 50 мл, фарфорова ступка, пробірки, піпетки, фільтри.

Хід роботи. Подрібнену на холоді м'язову тканину (2,5 г) розти­рають у ступці з 10 мл розчину трихлороцтової кислоти. Утворену суспензію переносять у колбу, ополіскуючи ступку 20 мл розчину трихлороцтової кислоти й потім 10 мл води. Об'єм рідини, в колбі доливають водою до риски. Після старанного перемішування вміст колби центрифугують протягом 10 хв за 600g або фільтрують. У одну пробірку об'ємом 10 мл (досліджувана проба) наливають 2 мл фільтрату, у другу пробірку (контрольна проба) — 2 мл во­ди. Потім у пробірки додають по 0,5 мл розчину молібдату амонію та по 1 мл розчину аскорбінової кислоти. Вміст пробірок добре перемішують і через 10 хв фотометрують із червоним світлофіль­тром.

Вміст неорганічного фосфору, мг, розраховують за такою фор­мулою:

С = лс-50-ЮО/о-2-1000,

де х - концентрація фосфору в досліджуваному розчині, знайде­на за калібрувальною кривою; 50 - об'єм суспензії тканини, мл; 2 - об'єм фільтрату, взятого для визначення, мл; а - наважка м'язів, г.

Вміст фосфору визначають за допомогою калібрувальної кри­вої. Для цього у мірні пробірки об'ємом 10 мл наливають по 2 мл стандартних розчинів, що містять 2-20 мкг фосфору, й додають усі потрібні для кольорової реакції реактиви. Одночасно готують контрольну пробу. Вміст пробірок перемішують і через 10 хв фотометрують. Потім будують калібрувальну криву.

На осі абсцис відкладають значення концентрації фосфору в стандартних розчинах і проводять прямі лінії паралельно осі орди­нат, а на осі ординат—відповідні значення екстракції щодо кон­тролю й також проводять прямі лінії паралельно осі абсцис. Точ­ку перетину проведених ліній сполучають. Утворюється калібру­вальна крива. Для визначення вмісту фосфору в розчині невідомої концентрації знаходять його екстракцію й відкладають її значен­ня на осі ординат. Потім проводять пряму лінію паралельно осі абсцис до перетину з калібрувальною кривою. З точки перетину проводять лінію, паралельну осі ординат. У точці перетину з віс­сю абсцис знаходять концентрацію фосфору, відповідну певній екстракції.

5. Визначення заліза в крові.

Принцип методу. Метод ґрунтується на здатності іонів заліза утворювати з роданистими солями сполуки, забарвлені в інтенсив­но червоний колір. Реакція відбувається за рівнянням:

ЗШ₄СН5 + РеСІз -*• Ре (€N5) ₃ + ЗМН₄С1.

Вміст заліза в організмі людини становить близько 3,5 г, з яких 2,5 г припадає на еритроцити. Кількість заліза в крові люди­ни досягає 45—50 мг, причому головна більшість його входить до складу гемоглобіну.

Матеріали та реактиви. Кров; концентрована Н₂ЗО₄; 30 %-й розчин Н₂О₂; насичений розчин гШ₄СК5; стандартний розчин три­валентного заліза: 0,248 г хімічно чистого Ре5О₄-7Н₂О розчиня­ють у невеликій кількості води, додають 10 мл концентрованої Н₂5О₄ і по краплях 0,1 моль/л розчин КМпО₄ до появи ледве по­мітного рожевого забарвлення, розчин переносять у мірну колбу об'ємом 1 л і доливають води до риски. Замість РеЗО₄-7Н₂О мож­на використати сіль Мора Ре(КН₄5О₄)₂-6Н₂О (0,3516 г). Розчин готують за наведеною методикою. Обидва розчини містять по 0,05 мг заліза в 1 мл.

Обладнання. Фотоелектроколориметр, газовий пальник, колби об'ємом 25 мл, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В пробірку вносять 0,1 мл крові, додають 0,5 мл концентрованої Н₂ЗО₄ і спалюють до появи білої пари сірчаної кислоти. Потім пробірку охолоджують, додають одну краплину розчину НгОг, знову спалюють до повного зникнення забарвлення розчину. Після охолодження розчин переносять у колбу об'ємом 25 мл, доливають до риски насичений розчин І^І^СМЗ, перемішу­ють і через 10 хв колориметрують.

Одночасно з цим у другу колбу вносять 0,5 мл стандартного розчину заліза (0,025 мг), доливають до риски насичений розчин МН₄СМ5, перемішують і через 10 хв використовують як стандарт.

Кількість заліза в 100 мл крові розраховують за формулою

С = 0,025£ст-10-100/£_ж,

де Е_СІ — екстинкція стандартного розчину; £_х — екстинкція дослі­джуваної проби; 0,025, 10, 100 — коефіцієнти.