6. Возбудитель ботулизма, свойства, типы токсинов.

С. botulinum — довольно крупные полиморфные палочки с закругленными концами, длиной 4—9 мкм, диаметром 0,5—1,5 мкм, иногда образуются укороченные формы; располагаются беспорядочно, иногда парами или в виде коротких цепочек; в старых культурах могут образовывать длинные нити; грамположительны, подвижны, имеют перитрихиальные жгутики. Капсулы не образуют, споры овальные, располагаются субтерминально, придавая палочке форму, напоминающую теннисную ракетку (рис. 106). Споры в культурах появляются через 24—48 ч от начала инкубации. С. botulinum не размножается в продуктах при кислой реакции (рН 3,0—4,0) и при концентрации NaCl выше 10 %.

С. botulinum образует 8 типов токсинов: А, В, Cl, C2, D, E, F, G, различающихся по антигенной специфичности.

Структура, активация, механизм действия ботулотоксина.

С. botulinum может продуцировать несколько типов токсических комплексов. Функции нетоксических негемагглю-тинирующих, как и гемагглютинирующих белков (их идентифицировано три типа: 15 кД, 35 кД и 70 кД), пока не установлены.

Нейротоксические компоненты любого серотипа ботулинических токсинов и любого типа токсического комплекса имеют сходную структуру и биологические свойства. Они синтезируются в виде единой полипептидной цепи с м. м. 150 кД (7S-токсин), которая не обладает значительной токсической активностью. Эта полипептидная цепь превращается в активный нейротоксин только после ее разрезания бактериальной протеазой или протеазами кишечного тракта человека. В результате точечного гидролиза возникает структура, состоящая из двух связанных между собой дисульфидными связями цепей — тяжелой, с м. м. 100 кД (Н-цепь), и легкой, с м. м. 50 кД (L-цепь). Н-цепь ответственна за прикрепление нейротоксина к рецепторам мембраны клеток, а L-цепь осуществляет специфическое блокирующее действие нейротоксина на холинергическую передачу возбуждения в синапсах.

Ботулизм, патогенез, микробиологическая диагностика

Особенности патогенеза и клиники. Ботулизм протекает как токсикоинфекция. Организм поражается не только токсином, содержащимся в пищевом продукте, но и токсином, который образуется в пищеварительном тракте и тканях в связи с проникновением туда возбудителя. Люди чрезвычайно чувствительны к ботулиническим токсинам типов А, В, С, Е и F. Заболевания наблюдались даже тогда, когда человек брал в рот зараженный продукт, но не проглатывал его. Смертельная доза токсина для человека составляет 1 нг/кг массы тела. Ботулинический токсин быстро всасывается в желудке и кишечнике, проникает в кровь и избирательно действует на ядра продолговатого мозга и ганглиозные клетки спинного мозга. Следует отметить, что, попадая в пищеварительный тракт человека или животного, клостридии ботулизма размножаются, проникают в кровь и оттуда во все органы, продуцируя при этом токсины. Инкубационный период у людей варьирует от двух часов до 10 дней, но чаще всего он составляет 18—24 ч. Чем больше инфицирующая доза, тем короче инкубационный период и тем тяжелее протекает заболевание.

Лабораторная диагностика. Материалом для исследования служат: от больного — промывные воды желудка, испражнения, кровь, моча, рвотные массы; от трупа — содержимое желудка, тонких и толстых кишок, лимфатические узлы, а также головной и спинной мозг. Исследованию подвергают и продукт, послуживший причиной отравления. Исследования проводят с целью обнаружения и идентификации С. botulinum или, чаще всего, с целью обнаружения ботулинического токсина и установления его серотипа. Для выделения культуры С. botulinum материал засевают на плотные среды и накопительную среду Китта—Тароцци (часть пробирок при этом прогревают при температуре 85 °С в течение 20 мин для уничтожения неспорогенных бактерий). Из жидких культур после инкубирования делают посевы на плотные среды с целью получения изолированных колоний, а затем и чистых культур, которые идентифицируют по морфологическим, культуральным, биохимическим и токсигенным свойствам. Для обнаружения ботулинического токсина в исследуемом материале или в фильтрате полученной культуры можно использовать следующие три способа.

1. Биологическая проба на мышах. Для этого берут не менее 5 мышей. Одну из них заражают только исследуемым материалом, а каждую из остальных четырех — смесью материала с 200 АЕ антитоксической сыворотки соответствующего типа — А, В, С и Е. Смесь при комнатной температуре выдерживают 40 мин для нейтрализации токсина антитоксином. При наличии в исследуемом материале ботулинического токсина погибают все мыши, кроме той, которой была введена смесь материала с антитоксической сывороткой, нейтрализовавшей действие гомологичного типа токсина.

2. Использование РПГА с антительным диагностикумом, т. е. эритроцитами, сенсибилизированными антитоксинами соответствующих типов.

3. Высокочувствительный и специфический метод обнаружения ботулинического токсина основан на его способности подавлять активность фагоцитов. В присутствии соответствующей антитоксической сыворотки лейкотоксическое свойство токсина нейтрализуется.

«КАПЕЛЬНЫЕ» ИНФЕКЦИИ

1. Возбудитель дифтерии. Характеристика морфологических, культуральных и биохимических свойств. Типы дифтерийной палочки. Токсин, структура, механизм действия, генетический контроль синтеза токсина. Патогенез дифтерии. Специ­фическая профилактика.

Дифтерия — острое инфекционное заболевание преимущественно детского возраста, которое проявляется глубокой интоксикацией организма дифтерийным токсином и характерным фибринозным воспалением в месте локализации возбу­дителя. Название болезни происходит от греческого слова diphthera — кожа, плен­ка, так как в месте размножения возбудителя образуется плотная, серовато-белого цвета пленка.

Возбудитель дифтерии — Corynebacterium diphtheriae — был обнаружен впервые в 1883 г. Э. Клебсом в срезах из пленки, получен в чистой культуре в 1884 г. Ф. Леф- флером. В 1888 г. Э. Ру и А. Иерсен обнаружили его способность продуцировать эк­зотоксин, играющий главную роль в этиологии и патогенезе дифтерии. Получение в 1892 г. антитоксической сыворотки Э. Берингом и использование ее с 1894 г. для лечения дифтерии позволило значительно снизить летальность. Успешное наступле­ние на эту болезнь началось после 1923 г. в связи с разработкой Г. Районом метода получения дифтерийного анатоксина.

Возбудитель дифтерии относится к роду Corynebacterium (класс Actinobacteria). В морфологическом отношении характеризуется тем, что клетки булавовидно утол­щены на концах (греч. согупе — булава), образуют ветвление, особенно в старых культурах, и содержат зернистые включения.

В состав рода Corynebacterium входит большое число видов, которые делят на три группы.

1)Коринебактерии — паразиты человека и животных и патогенные для них.

2)Коринебактерии, патогенные для растений.

3)Непатогенные коринебактерии. Многие виды коринебактерий являются нор­мальными обитателями кожи, слизистых зева, носоглотки, глаз, дыхательных пу­тей, уретры и половых органов.

С. diphtheriae — прямые или слегка изогнутые неподвижные палочки длиной 1,0-8,0 мкм и диаметром 0,3-0,8 мкм, спор и капсул не образуют. Очень часто они имеют вздутия на одном или обоих концах, часто содержат метахроматические гра­нулы — зерна волютина (полиметафосфаты), которые при окрашивании метилено- вым синим приобретают голубовато-пурпурный цвет. Для их обнаружения предло­жен особый метод окрашивания по Нейссеру. При этом палочки окрашиваются в со­ломенно-желтый, а зерна волютина — в темно-коричневый цвет, и располагаются обычно по полюсам. С. diphtheriae хорошо окрашивает ся анилиновыми красителями, грамположительна, но в старых культурах нередко обесцвечивается и имеет отрицательную окраску по Граму. Для нее характерен вы­раженный полиморфизм, особенно в старых культурах и под влиянием антибиоти­ков (см. рис. 102.1). Содержание Г + Ц в ДНК около 60 мол %.

Дифтерийная палочка является аэробом или факультативным анаэробом, темпе­ратурный оптимум для роста 35—37 °С (границы роста 15—40 °С), оптимальная рН 7,6—7,8. К питательным средам не очень требовательна, но лучше растет на сре­дах, содержащих сыворотку или кровь. Избирательными для дифтерийных бакте­рий являются свернутые сывороточные среды Ру или Леффлера, рост на них появ­ляется через 8—12 ч в виде выпуклых, величиной с булавочную головку колоний се­ровато-белого или желтовато-кремового цвета. Поверхность их гладкая или слегка зернистая, на периферии колонии несколько более прозрачные, чем в центре. Коло­нии не сливаются, вследствие чего культура приобретает вид шагреневой кожи. На бульоне рост проявляется в виде равномерного помутнения, либо бульон остается прозрачным, а на его поверхности образуется нежная пленка, которая постепенно утолщается, крошится и хлопьями оседает на дно.

Особенностью дифтерийных бактерий является их хороший рост на кровяных и сывороточных средах, содержащих такие концентрации теллурита калия, которые по­давляют рост других видов бактерий. Это связано с тем, что С. diphtheriae восстанавли­вают теллурит калия до металлического теллура, который, откладываясь в микробных клетках, придает колониям характерный темно-серый или черный цвет. Применение таких сред повышает процент высеваемости дифтерийных бактерий (рис. 103).

С. diphtheriae ферментируют глюкозу, мальтозу, галактозу с образованием кислоты без газа, но не ферментируют (как правило) сахарозу, имеют цистиназу, не имеют уреазы и не образуют индола. По этим признакам они отличаются от тех коринеформ- ных бактерий (дифтероидов), которые чаще других встречаются на слизистой обо­лочке глаза (С. xerosus) и носоглотки (С. pseudodiphtheriticum) и от других дифтероидов (табл. 44).

В природе существуют три основных варианта (биотипа) дифтерийной палочки: gravis, intermedins и mitis. Они различаются по морфологическим, культуральным, биохимическим и другим свойствам.

Экзотоксин синтезируется в виде неактивного предшественника - единой поли­пептидной цепи с м. м. 61 кД. Его активация осуществляется собственной бактери­альной протеазой, которая разрезает полипептид на два связанные между собой ди- сульфидными связями пептида: А (м. м. 21 кД) и В (м. м. 39 кД). Пептид В выполняет акцепторную функцию — он распознает рецептор, связывается с ним и формирует внутримембранный канал, через который проникает в клетку пептид А и реализует биологическую активность токсина. Пептид А представляет собой фермент АДФ- Рибозилтрансферазу, который обеспечивает перенос аденозиндифосфатрибозы из НАД на один из аминокислотных остатков (гистидина) белкового фактора элонга­ции EF-2. В результате модификации EF-2 утрачивает свою активность, и это приводит подавлению синтеза белка рибосомами на стадии транслокации. Токсин синтези­руют только такие С. diphtheriae, которые несут в своей хромосоме гены умеренного конвертирующего профага. Оперон, кодирующий синтез токсина, является моноци- стронным, он состоит из 1,9 тыс. пар нуклеотидов и имеет промотор toxP и 3 участ-ка: toxS, toxA и toxB. Участок toxS кодирует 25 аминокислотных остатков сигнально­го пептида (он обеспечивает выход токсина через мембрану в периплазматическое пространство бактериальной клетки), toxA — 193 аминокислотных остатка пептида А, и toxB — 342 аминокислотных остатка пептида В токсина. Утрата клеткой профага или мутации в tox-опероне делают клетку малотоксигенной. Напротив, лизогениза- ция нетоксигенных С. diphtheriae конвертирующим фагом превращает их в токсиген- ные бактерии. Это доказано однозначно: токсигенность дифтерийных бактерий зависит от лизогенизации их конвертирующими tox-коринефагами. Коринефаги ин­тегрируются в хромосому коринебактерий с помощью механизма сайт-специфичес­кой рекомбинации, причем штаммы дифтерийных бактерий могут содержать в своих хромосомах по 2 сайта рекомбинации (attB), и коринефаги интегрируются в каждый из них с одинаковой частотой.

Генетический анализ ряда нетоксигенных штаммов дифтерийных бактерий, про­веденный с помощью меченых ДНК-зондов, несущих фрагменты tox-оперона кори- нефага, показал, что в их хромосомах имеются последовательности ДНК, гомоло­гичные Юх-оперону коринефага, но они либо кодируют неактивные полипептиды, либо находятся в «молчащем» состоянии, т. е. неактивны. В связи с этим возникает очень важный в эпидемиологическом отношении вопрос: могут ли нетоксигенные дифтерийные бактерии превращаться в токсигенные в естественных условиях (в ор­ганизме человека), подобно тому, как это происходит in vitro? Возможность подоб­ного превращения нетоксигенных культур коринебактерий в токсигенные с помощью фаговой конверсии была показана в опытах на морских свинках, куриных эмбрио­нах и белых мышах. Однако происходит ли это в ходе естественного эпидемическо­го процесса (и если происходит, то как часто), пока установить не удалось.

В связи с тем, что дифтерийный токсин в организме больных оказывает избира­тельное и специфическое воздействие на определенные системы (поражаются в ос­новном симпатико-адреналовая система, сердце, сосуды и периферические нервы), то очевидно, он не только угнетает биосинтез белка в клетках, но и вызывает другие нарушения их метаболизма.

Особенности патогенеза и клиники. К дифтерии восприимчивы люди любого возраста. Возбудитель может проникнуть в организм человека через слизистые обо­лочки различных органов или через поврежденную кожу. В зависимости от локали­зации процесса различают дифтерию зева, носа, гортани, уха, глаза, половых органов и кожи. Возможны смешанные формы, например дифтерия зева и кожи и т. п. Инку­бационный период — 2—10 дней. При клинически выраженной форме дифтерии в месте локализации возбудителя развивается характерное фибринозное воспаление слизистой оболочки. Токсин, вырабатываемый возбудителем, сначала поражает эпителиальные клетки, а затем близлежащие кровеносные сосуды, повышая их проницаемость. В выходящем экссудате содержится фибриноген, свертывание кото­рого приводит к образованию на поверхности слизистой оболочки серовато-белого Цвета пленчатых налетов, которые плотно спаяны с подлежащей тканью и при отры­ве От нее вызывают кровотечение. Следствием поражения кровеносных сосудов мо­жет быть развитие местного отека. Особенно опасной является дифтерия зева, так ^как она может стать причиной дифтерийного крупа вследствие отека слизистой обо­лочки гортани и голосовых связок, от которого раньше погибало в результате ас- фиксии 50—60 % больных дифтерией детей. Дифтерийный токсин, поступая ^в кровь, вызывает общую глубокую интоксикацию. Он поражает преимущественно сердечно-сосудистую, симпатико-адреналовую системы и периферические нервы, аким образом, клиника дифтерии складывается из сочетания местных симптомов, зависящих от локализации входных ворот, и общих симптомов, обусловленных от­равлением токсином и проявляющихся в виде адинамии, вялости, бледности кож­ных покровов, понижения кровяного давления, миокардита, паралича перифериче­ских нервов и других нарушений. Дифтерия у привитых детей, если и наблюдается, протекает, как правило, в легкой форме и без осложнений. Летальность в период до применения серотерапии и антибиотиков составляла 50—60 %, ныне — 3—6 %.

Специфическая профилактика. Основным методом борьбы с дифтерией является массовая плановая вакцинация населения. С этой целью используют раз­личные варианты вакцин, в том числе комбинированные, т. е. направленные на од­новременное создание иммунитета против нескольких возбудителей. Наибольшее распространение в России получила вакцина АКДС. Она представляет собой ад­сорбированную на гидроокиси алюминия взвесь коклюшных бактерий, убитых формалином или мертиолятом (20 млрд в 1 мл), и содержит дифтерийный анаток­син в дозе 30 флоккулирующих единиц и 10 единиц связывания столбнячного ана­токсина в 1 мл. Вакцинируют детей с 3-месячного возраста, а затем проводят ре­вакцинации: первую через 1,5—2 года, последующие в возрасте 9 и 16 лет, а далее через каждые 10 лет.