2.2. Ультрацентрифугирование

Ультрацентрифугирование — метод разделения и исследования высокомолекулярных соединений, вирусов и субклеточных частиц с помощью ультрацентрифуги. Метод заключается в том, что белки в центрифужной пробирке помещают в ротор ультрацентрифуги. При враще­нии ротора скорость оседания белков пропорцио­нальна их молекулярной массе: более тяжёлые бел­ки образуют фракции, расположенные ближе ко дну кюветы, более лёгкие — к поверхности.

Принято различать 2 типа ультрацентрифугирования: препаративное и аналитическое.

Препаративное ультрацентрифугирование применяют для фракционирования и выделения биополимеров в количествах, достаточных для практических целей. Широко используют ультрацентрифугирование в градиенте плотности растворов сахарозы, глицерина, декстринов; оно позволяет разделять смеси веществ на отдельные компоненты, различающиеся эффективной массой и коэффициентом трения частиц или молекул. Применение зональных и проточных роторов дало возможность значительно повысить объёмы растворов фракционируемых частиц и использовать их для очистки вируса гриппа при изготовлении вакцин.

Препаративные ультрацентрифуги развивают скорость до 75000 об/мин и максимальное угловое ускорение 510000g. Они снабжены как холодильником, так и вакуумной установкой, чтобы предотвратить перегрев воздуха вследствие трения его о воздух. Роторы таких центрифуг изготавливают из высокопрочных алюминиевых и титановых сплавов. Для уменьшения вибраций, возникающих вследствие неравномерного наполнения пробирок, ультрацентрифуги имеют гибкий вал. Пробирки для центрифугирования и их содержимое должны быть тщательно уравновешены с точностью до 0,1г.

Аналитическое ультрацентрифугирование используют для исследования гомогенности (чистоты) препаратов биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов), а также для определения констант седиментации, молекулярной массы, констант ассоциации и размеров макромолекул. Ультрацентрифугирование применяется в медицине при клинической диагностике, для приготовления кровезаменителей и т.п.

Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 70000 об/мин, при этом ускорение до 500000g. Ротор у них, как правило, имеет форму эллипсоида и соединен посредством струны с двигателем, что позволяет варьировать скорость вращения ротора. Ротор вращается в вакуумной камере снабженной холодильной установкой, и имеет две ячейки аналитическую и балансировочную, которые устанавливаются в центрифуге строго вертикально параллельно оси вращения.

Балансировочная ячейка служит для уравновешивания аналитической и представляет собой металлический блок с прецизионной системой. В ней имеются два индексных отверстия, находящиеся на строго определенном расстоянии от оси вращения, с помощью которых определяют соответствующие расстояния аналитической ячейки. Аналитическая ячейка, емкость которой, как правило, равна 1 см³, имеет секторальную форму. При правильной установке в роторе она, несмотря на то, что стоит вертикально, работает по тому же принципу, что и ротор с подвесными стаканами, создавая практически идеальные условия седиментации.