Катаболизм.

Катаболизмом называют метаболические процессы, при которых расщепляются относительно крупные органические молекулы сахаров, жиров, аминокислот. В ходе катаболизма образуются более простые органические молекулы, необходимые для реакций анаболизма (биосинтеза). Часто, именно в ходе реакций катаболизма организм мобилизует энергию, переводя энергию химических связей органических молекул, полученных в процессе переваривания пищи, в доступные формы: в виде АТФ, восстановленных коферментов и трансмембранного электрохимического потенциала. Термин катаболизм не является синонимом «энергетического обмена»: у многих организмов (например, у фототрофов) основные процессы запасания энергии не связаны напрямую с расщеплением органических молекул. Классификация организмов по типу метаболизма может быть основана на источнике получения энергии и углерода, что отражено в таблице ниже. Органические молекулы используются в качестве источника энергии органотрофами, литотрофы используют неорганические субстраты, а фототрофы потребляют энергию солнечного света. Однако, все эти различные формы обмена веществ зависят от окислительно-восстановительных реакций, которые связаны с передачей электронов от восстановленных доноров молекул, таких как органические молекулы, вода, аммиак, сероводород, на акцепторные молекулы, такие как кислород, нитраты или сульфат. У животных эти реакции сопряжены с расщеплением сложных органических молекул до более простых, таких как двуокись углерода и воду. В фотосинтезирующих организмах – растениях и цианобактериях – реакции переноса электрона не высвобождают энергию, но они используются как способ запасания энергии, поглощаемой из солнечного света.

Анаболизм.

Анаболизм – совокупность метаболических процессов биосинтеза сложных молекул с затратой энергии. Сложные молекулы, входящие в состав клеточных структур, синтезируются последовательно из более простых предшественников. Анаболизм включает три основных этапа, каждый из которых катализируется специализированным ферментом. На первом этапе синтезируются молекулы-предшественники, например, аминокислоты, моносахариды, терпеноиды и нуклеотиды. На втором этапе предшественники с затратой энергии АТР преобразуются в активированные формы. На третьем этапе активированные мономеры объединяются в более сложные молекулы, например, белки, полисахариды, липиды и нуклеиновые кислоты. Не все живые организмы могут синтезировать все биологически активные молекулы. Автотрофы (например, растения) могут синтезировать сложные органические молекулы из таких простых неорганических низкомолекулярных веществ, как углекислый газ и вода. Гетеротрофам необходим источник более сложных веществ, таких как моносахариды и аминокислоты, для создания более сложных молекул. Организмы классифицируют по их основным источникам энергии: фотоавтотрофы и фотогетеротрофы получают энергию из солнечного света, в то время как хемоавтотрофы и хемогетеротрофы получают энергию из неорганических реакций окисления.

12.Аппараты и процессы выделения продуктов биосинтеза.

Если продукт локализован внутри клеток, их разрушают, удаляют клеточные осколки и выделяют продукты из осветленной среды; секретируемый продукт выделяют непосредственно из среды.

Для отделения биомассы клеток или культуралъной жидкости используют сепараторы, осадительные центрифуги, фильтр-прессы, вакуум-барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, отстойники. Выбор оборудования зависит от масштаба культивирования, типа кле­ток, свойств культуральной жидкости. 

Для выделения клеток из больших объемов культуральной среды (в промышленных масштабах) используют высокоскоростное центрифугирование с помощью соответствующих центрифуг полунепрерывного действия. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан центрифуги, клетки концентрируются в нем, осветленная жидкость удаляется. Когда барабан заполняется осажденными клетками, центрифугу останавливают и клетки собирают. Неудобство этого способа - необходимость остановки процесса, вероятность утечки микроорганизмов в окружающую среду, невозможность полного удаления клеток из среды.

Альтернативный метод выделения клеток из культуральной среды — фильтрация через мембрану. Но процесс фильтрации быстро замедляется за счет накопления клеток на поверхности фильтра. Увеличение дав­ления фильтруемой среды дает временный эффект, так как клетки заби­вают поры, образуя менее проницаемый слой.

Разрушение (дезинтеграция) клеток. Для этой цели применяют разнообразные химические, биологические, физические методы. Все процедуры должны быть одновременно достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и достаточно мягкими для исключения денатурации белка (изменения структуры конечного продукта).

Клеточные стенки микроорганизмов состоят из разных полимеров, поэтому универсального метода их разрушения не существует.

У грамположителъных микроорганизмов клеточная стенка состоит из толстого пептидогликанового слоя N-ацетилглюкозамина и остатков N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных пептидными мостиками.

У грамотрицателъных бактерий клеточная стенка тоньше и покрыта снаружи слоем липидов.

Стенка дрожжевых клеток состоит из плотного слоя частично фосфорилированных маннатов и Р-глюканов.

Низшие грибы имеют многослойные клеточные стенки, состоящие из а- и Р-глюканов, гликопротеидов и хитина.

Состав и прочность клеточной стенки зависят от условий культиви­рования, скорости роста клеток, фазы, на которой они собираются, условий хранения сконцентрированных клеток и от того, экспрессировал ли выделенный микроорганизм клонированный ген.

Химический метод разрушения клеточных стенок - обработка ще­лочью. Если белковый продукт не разрушается при рН от 10,5 до 12,5, то можно без труда лизировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантный гормон роста человека очень просто выделить из клеток Е. соli обработкой натрия гидрокарбонатом при рН 11. После обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки, что автоматически решает проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов.

Основной биохимический метод разрушения клеток микроорганиз­мов - лизис с помощью ферментов. Так, лизоцим яичного белка легко гидролизует клеточные стенки грамположительных бактерий. Для раз­рушения клеток грамотрицательных бактерий используют лизоцим и ЭДТА. Клеточные стенки дрожжей и плесневых грибов гидролизуют одним или несколькими ферментами: фосфоманназой, [B-1,3- и B-1,6-глюканазой, хитиназой - или комплексным дрожжелитическим препа­ратом. Ферментативная обработка высокоспецифична, а лизис происхо­дит в мягких условиях.

Клетки можно разрушать физическими методами: немеханически­ми (осмотическим шоком или быстрым многократным замораживани­ем-оттаиванием), механическими (обработкой УЗ, соударением, гомогенизацией под давлением). Механическое разрушение высокоэффективно, особенно УЗ-излучателями, генерирующими высокочастотные звуковые волны. УЗ-дезинтеграторы состоят из транзисторного генератора УЗ-волн, пьезоэлектрического или магнитострикционного преобразователя, набора рабочих камер (аппарат на основе УЗ-диспергатора

УЗДН-1, Россия).

При большом количестве клеток используют баллистическую дезинтеграцию, ее проводят в высокоскоростных шаровых мельницах, куда помещают концентрированную суспензию клеток. Камера мельницы заполнена инертным абразивным материалом (стеклянными, по­лимерными шариками диаметром 1 мм). Содержимое быстро перемешивают лопасти, насаженные на ось. Большинство клеток разрушаются под действием сдвиговых напряжений, возникающих в результате быстрого движения шариков относительно друг друга, поверхности лопастей и камеры. Условия оптимального разрушения клеток подбирают, варьируя числом и формой лопастей, скоростью перемешивания, числом и размером шариков, геометрией камеры, температурой, концентрацией клеток (аппараты фирмы «Willi A.. Васhhоtеm», Швейцария,(

Gifford Wood Со», США).

Соударение - клеточную суспензию большой вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность, в месте соприкосновения выделяется большое количество энергии, разрушающей клетки. Активность клеточных белков при разрушении клеток методом соударения уменьшается незначительно.

Экструзионные методы (продавливание суспензии клеток через капиллярные отверстия) предназначены для обработки жидких или за­мороженных суспензий клеток. Диаметр отверстий рабочих матриц со­ставляет от нескольких миллиметров до десятых его долей. В гидроэкс-трудерах давление достигает 2000-4000 кг/см², в твердофазовых экс-трудерах - 10000-50000 кг/см². После экструзии давление резко сбра­сывают, что вызывает лизис клеток. Экструзионные дезинтеграторы производят фирмы «Маnton Gaulin» (США), LКВ (Швеция).