2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы исследования

Испытания проводились в национальном центре экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники «Дәрі-дәрмек» МЗ и СР РК.

Материалами исследования служили: для тестирования пирогенности: половозрелые кролики весом от 2-х до 4-х килограмм, шприцы с объемом 10 мл, дистиллированная вода, термостат, стерилизованные пипетки и пробирки, апирогенная вода для ЛАЛ-теста, водяная баня, инфузионные растворы.

2.2. Методы исследования

Испытание на бактериальные эндотоксины

Данный раздел частично гармонизирован с соответствующими текстами Государственной Фармакопеей Республики Казахстан и Аналитическим нормативным документом Республики Казахстан.

Испытание проводят с использованием ЛАЛ, полученного из экстракта амебоцитов мечехвоста, приготовленного и рекомендованного к применению в качестве ЛАЛ-реактива.

Испытание проводят двумя методами: гель-тромб, который основан на образования геля, и фотометрический метод. В последствии были разработаны турбидиметрический метод, основанный на появлении мутности после расщепления эндогенного субстрата, а также хромогенный метод, который основан на развитии окраски после разложения синтетического пептидно-хромогенного комплекса. Испытание проводят любым из этих двух методов, если в частности фармакопейной статье не указано иное. В сомнительных случаях окончательное решение принимают на основании результатов, полученных методом гель-тромб теста, если в частной фармакопейной статье не указано иное.

Объектами испытания являются растворы для инфузионной терапии: раствор глюкозы, раствор натрия хлорида и ацесоль.

Приборы и стеклянная посуда.

Используя валидированный процесс, депирогенизируют всю стеклянную посуду и другие термостабильные материалы в сухожаровом шкафу.

Стерилизацию обычно проводят минимум в течение 30 минут при температуре 250 С. Если используют устройство из пласмассы, такие как микропланшеты и наконечники для автоматических пипеток, то они должны быть апирогенными и не влиять на результаты испытания.

Приготовление основного раствора стандарта эндотоксина и его рабочих растворов.

Стандартный образец эндотоксина Фармакопей США имеет установленную активность 10000 ЕЭ в одном флаконе. Содержимое одного флакона разводят в 5 мл воды для ЛАЛ-теста, периодически перемешивают в течение 30 минут с помощью вортекса. Этот концентрат используют для приготовления последующих разведений. Его хранят в холодильнике не более 14 сут. Перед использованием этот раствор тщательно перемешивают не менее трех минут с помощью вортекса. Каждое разведение перемешивают не менее 30 сперед приготовлением следующего разведения. Во избежание потери активности вследствие адсорбции эндотоксина разведения должны быть свежеприготовленными, если нет данных, указывающих обратное.

Готовят растворы образца путем растворения или разбавления лекарственного препарата и промывки медицинской аппаратуры водой для ЛАЛ-теста. Некоторые субстанции или препараты могут быть разбавлены, растворены или экстрагированы с помощью других подходящих водных растворов. При необходимости доводят рН раствора (или его разведения) таким образом, чтобы рН смеси ЛАЛ-реактива и образца находился в диапазоне, установленным производителем ЛАЛ-тест реактива. В большинстве случаев диапазон рН составляет 6,0 до 8,0. рН можно изменить, используя кислоту, основание или соответствующий буфер, рекомендованный производителем ЛАЛ-реактива. Кислоту и основание готовят с помощью концентрированных растворов или твердых веществ и воды ЛАЛ-теста в емкостях, не содержащих эндотоксин. Буфер должен быть проверен на отсутствие эндотоксина и мешающих факторов.

Максимально допустимое разведение(МДР) – максимально допустимое разведение образца, в котором может быть определено предельное содержание эндотоксинов. Это понятие применимо к инъекционным лекарственным средствам или растворам для парентерального введения в готовой или разведенной форме, или к количеству лекарственного средства по весу, если объем вводимой дозы различен. Основная формула для определения МДР выглядит следующим образом:

МДР=(предельный уровень эндотоксина х концентрация раствора испытуемого образца)/λ, где концентрация раствора образца и λ, т.е. заявленную чувствительность (ЕЭ/мл) ЛАЛ-реактива, используемого в данном методе. Если в частной фармакопейной статье уровень содержания эндотоксина указан в весовых единицах или в единицах активности препарата (ЕЭ/мл или ЕЭ на единицу действия), то для вычисления МДР умножают предельную концентрацию препарата (мг/мл или МЕ/мл) в испытуемом растворе или субстанции, и делят полученный результат на λ. Полученное таким образом значение МДР – предельное значение разведения препарата, при котором испытание можно считать достоверным.

Уровень бактериальных эндотоксинов, определенный на основании дозы препарата, равен:

К/М³, где К – пороговая величина пирогенной дозы эндотоксина на килограмм массы тела человека; М – максимальная доза препарата на килограмм массы тела человека, вводимая в течение часа. Уровень эндотоксина для парентеральных препаратов установлен в частных фармакопейных статьях в ЕЭ/мл, ЕЭ/мг или ЕЭ/единицы биологической активности.

Гель-тромб тест – метод обнаружения или определения количества эндотоксинов основанный на реакции гелеобразования ЛАЛ-реактива в присутствии эндотоксина. Чувствительность ЛАЛ-реактива, указанная на этикетке флакона, - концентрация эндотоксина, которая вызывает реакцию гелеобразования лизата при нормальных условиях опыта. Для того, чтобы обеспечить точность и достоверность результатов испытания, необходимо поверить и подтвердить заявленную чувствительность ЛАЛ-реактива и отсутствие мешающих факторов, согласно подразделу «Предварительные испытания при использовании метода гель-тромб теста».