1) Изучить и освоить принципы и методы фармакопейных тестирований на пирогенность и на наличие бактериальных эндотоксинов.

2) Провести испытания на наиболее широко применяемых инфузионных растворов.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1Литературный обзор

1.1 Пирогенность

Пирогены, встречающиеся в медицинских препаратах

Во многих словарях термин «пироген» объясняется таким образом: слово происходит от греческого “pyreto” – лихорадка. То есть, пирогенами называют те вещества, которые способны вызывать повышение температуры тела при попадании в кровь. Давайте разберем, какие вещества относятся к пирогенам: это – грамотрицательные бактерии и их токсины, вирусы и продукты их жизнедеятельности, лизированные микробные клетки и пр. По химическому составу пирогенные вещества представляют собой липополисахаридные или липополисахаридно-протеиновые комплексы наружных мембран грамотрицательных бактерий, так называемые – бактериальные эндотоксины. Пирогенные вещества – это высокомолекулярные соединения, они нелетучие и не перегоняются с водяным паром. Загрязнение жидкостей, в особенности, дистиллированной воды пирогенными веществами происходит чаще всего в результате переброса капельной фазы, содержащей пирогенные вещества, из испарителя в конденсатор и сборник аквадистиллятора.

Пирогены– термостабильные вещества, они разрушаются только при нагревании в суховоздушных стерилизаторах при температуре 250°С в течение 30 минут. При воздействии пара под давлением (t 120°Савтоклавированием) в растворах пирогены разрушаются только через 5 часов. Следовательно, освободиться от пирогенных веществ в воде и инъекционных растворах при помощи термической стерилизации практически невозможно. Таким образом, каждый инъекционный раствор после его правильной стерилизации стерилен, но не каждый стерильный раствор – апирогенен.Стерильность и апирогенность – разные понятия и подменять одно другим – нельзя[1].

Пирогенами называют эндогенные или экзогенные вещества, вызывающие пирогенные эффекты (лихорадку). Эндогенные пирогены вырабатываются в организме в ответ на различные стимулы; чаще всего это инфекция или воспаление. Экзогенные пирогены представлены в основном микроорганизмами, их токсинами и продуктами жизнедеятельности. Типичный пример экзогенногопирогена - эндотоксин. Он представляет собой липополисахарид наружной мембраны грамотрицательных бактерий и состоит из липида А(рисунок 1), полисахаридного ядра и боковой цепи - O-полисахарида. Последовательность олигосахаридов в боковой цепи у всех бактерий разная. Липид А состоит из дисахарида, фосфата и жирных кислот.

Рисунок 1. Химическая структура О-специфической цепи Кор ЛипидаА[по 3].

Липид А состоит из дисахарида, фосфата и жирных кислот. Жирные кислоты, входящие в состав Липида А, могут быть насыщенными и ненасыщенными. Наиболее часто в состав Липида А входят кислоты: пальмитиновая, лауриновая, глутаминовая, меристиновая. Участок Липида А является наиболее константным участком молекулы ЛПС, и его строение схоже у многих бактерий.

О-специфическая цепь липополисахаридов построена из повторяющихся олигосахаридов. Наиболее распространенными сахарами, входящими в состав О-специфической цепи, являются глюкоза, галактоза, рамноза. Этот участок молекулы придает ей гидрофильные свойства, благодаря которым ЛПС хорошо растворимы в воде. Полисахаридная часть является наиболее вариабельной частью молекулы ЛПC. Часто этот фрагмент молекулы называют О-антигеном, так как именно он отвечает за антигенную активность грамотрицательных бактерий.

Кор - центральная часть молекулы, связывающая О-антиген с Липидом А. Формально структура кора подразделяется на внешнюю и внутреннюю части. В состав внутренней части кора обычно входят остатки L-глицеро-О-манногептозы и 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (КДО). КДО содержит 8 атомов углерода и в природе практически нигде больше не встречается.

Жирные кислоты, входящие в состав Липида А, могут быть насыщенными и ненасыщенными. Наиболее часто в состав Липида А входят кислоты: пальмитиновая, лауриновая, глутаминовая, меристиновая. Участок Липида А является наиболее константным участком молекулы ЛПС, и его строение схоже у многих бактерий.

Доза эндотоксина, способная вызвать у человека лихорадку , составляет 1 нг/кг. Большинство экзогенныхпирогенов вызывают лихорадку, стимулируя образование эндогенных пирогенов клетками макроорганизма (обычно это моноциты и макрофаги). Но из этого правила есть исключения. Так, эндотоксин вызывает лихорадку без участия эндогенныхпирогенов, воздействуя на эндотелиальные клетки в головном мозге[2].

Эндогенные пирогены включают иммунные комплексы, продукты распада комплемента, метаболиты стероидных гормонов, желчные кислоты и цитокины. Большинство эндогенныхпирогенов представляют собой полипептиды, которые вырабатываются многими клетками макроорганизма, особенно моноцитами и макрофагами. Они поступают в кровоток и вызывают лихорадку, воздействуя на терморегуляторный центр гипоталамуса [2].

Бактериальный эндотоксин является постоянным структурным компонентом наружной клеточной стенки грамотрицательных бактерий (рисунок 2). По структуре это липополисахарид (ЛПС), состоящий из липида А (базисной части или ядра) и О-специфичной цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными полисахаридными последовательностями. Живые организмы находятся в постоянном контакте с эндотоксином, так как в кишечнике обитает довольно большое количество грамотрицательных бактерий [5-7]. У человека в 1 мл плазмы крови содержится примерно 3-10 пкг эндотоксина[6]. У здоровых организмов имеются резервы связывания эндотоксина лейкоцитами[8]. В зависимости от концентрации эндотоксин может вызывать активацию лейкоцитов и макрофагов, стимуляцию продукции эндогенногопирогена. Бактериальные эндотоксины являются исключительно сильными пирогенами: для развития лихорадочного приступа достаточно присутствия в инфузионном растворе бактериальных эндотоксинов в концентрации 1 нг/мл. Возможна ответная активация антагонистов глюкокортикоидов, интерферона, интерлейкинов, фактора некроза опухоли (кахексина) и других медиаторов, а также синтеза белков острой фазы (в том числе амилоидного), миелопоэза, системы комплемента. Происходит поликлональная активация В-клеток. Так же в связи с этим могут появляться индукция развития провирусов, митогенный эффект, подавление тканевого дыхания, гиперлипидемия, диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови, эндотоксический шок и острая полиорганная недостаточность [10].

Рисунок 2. Строение клеточной стенки у грамположительных бактерий [по 4].

Несмотря на давние (начиная с 40-х годов ХХ в.) и разносторонние исследования, эндотоксин до сих пор остается объектом пристального внимания, в том числе и в связи со сложностью и многоликостью его физиологического воздействия на живой организм[12].

В настоящее время существует ряд иммунологических и биохимических методов, позволяющих определять содержание ЛПС в биологических жидкостях. Для определения содержания эндотоксина в лекарственных препаратах и изделиях медицинского назначения на протяжении более 30 лет успешно используется ЛАЛ-тест в различных модификациях[13]. Для сертификации фармацевтической и медицинской продукции на пирогенность ЛАЛ-тест включен в арсенал лабораторных методов многих стран. Этот метод основан на способности ЛПС вызывать коагуляцию белков, содержащихся в лизате амебоцитов мечехвоста. (Подробнее о ЛАЛ-тесте описано в разделе 1.2)[9-11].

Таким образом, значение эндотоксина велика в медицинской отрасли и, в общем, для ученых создается большой интерес в изучении природы эндотоксина, так как его динамичная эволюция не дает однозначных результатов в исследованиях. Наука и медицина, шагая вперед с новыми технологиями, дает возможность обезопасить применение лекарственных препаратов. Методы обнаружения бактериальных эндотоксинов будут описаны ниже.