7. Эксперимент Гриффита был выполнен в 1928 году Фредериком Гриффитом, доказывает, что бактерии способны передавать генетическую информацию по механизму трансформации.[1][2]

Гриффит заражал мышей двумя штаммами пневмококков (Streptococcus pneumoniae) — типа III-S (гладкие) и II-R (шероховатые). Пневмококки штамма III-S покрыты полисахаридной капсулой, которая защищает их от иммунной системы хозяина, и являются вирулентными, то есть способны приводить к смерти зараженной особи. Бактерии штамма II-R не имеют защитной капсулы и невирулентны.[3] До эксперимента Гриффита бактериологи полагали, что виды неизменны и сохраняют свои свойства из поколения в поколение.

В ходе эксперимента бактерии вирулентного штамма III-S убивали нагреванием и добавляли к бактериям штамма II-R. По отдельности убитые бактерии III-S и живые бактерии II-R не приводили к смерти мышей. Однако в крови мышей, умерших после введения смеси, были обнаружены бактерии обоих штаммов, III-S и II-R. Гриффит пришел к заключению, что невирулентные бактерии штамма II-R трансформировались в вирулентный штамм каким-то компонентом убитого штамма III-S.

В настоящее время известно, что «трансформирующим началом» в эксперименте Гриффита была ДНК штамма III-S. Нагревание убивало бактерии, однако их ДНК оставалась неповрежденной и в ходе эксперимента захватывалась бактериями штамма II-R. Бактерии штамма III-S содержат гены, кодирующие компоненты, необходимые для синтеза полисахаридной оболочки. Бактерии штамма II-R, получившие эти гены, получали защиту от иммунной системы мыши и убивали последних. Штамм бактерий в ходе эксперимента изменялся.

Точная природа трансформирующего начала (ДНК) была установлена в эксперименте Эвери, Маклеода и Маккарти, а также в эксперименте Херши и Чейз.

8. Трансформация (от латрансформация transformatio - превращение), в молекулярной генетике, изменение наследственных свойств клеток в результате проникновения в них чужеродной днк.

В результате трансформация клетка-реципиент может приобрести и устойчиво передавать своим потомкам признак, ранее у нее отсутствующий, но имеющийся у клетки донора (напр., ген устойчивости к антибиотикам).

трансформация у мн. бактерий (пневмококки, стрептококки, гемофиль-ные бактерии, бациллы)-естественный процесс, происходящий в прир. популяциях. При этом клетки, способные поглощать и включать в свою хромосому чужеродную ДНК, находятся в состоянии трансформация наз. компетентности (готовности), наступающем в определенный период жизненного цикла (конец фазы роста). Развитие компетентности может идти по "каскадному" типу: клетки, ставшие компетентными, выделяют в среду низкомол. белок (трансформация наз. фактор компетентности), который, адсорбируясь на др. клетках, делает их также компетентными.

Механизм трансформация включает необратимую адсорбцию ДНК клетки-донора (напр., выделяемую в среду в результате лизиса клеток) на пов-сти клетки-реципиента. Хорошо адсорбируется лишь ДНК, имеющая мол. массу не менее 300 тыс. У большинства бактерий адсорбироваться может ДНК любого происхождения. У гемофильных бактерий адсорбируются лишь такие фрагменты ДНК, которые несут специфич. последовательности из 11 пар нуклеотидов, характерных лишь для ДНК таких бактерий. Видоспецифич. адсорбция характерна также для гонококков. Адсорбция осуществляется на спец. рецепторах, где ДНК связывается с особыми белками и "втягивается" в клетку. При этом одна из нитей ДНК разрушается благодаря нуклеазной активности связывающих ДНК белков, и в клетку поступает уже однонитевая ДНК. Она тут же обволакивается молекулами белков, которые защищают ДНК от клеточных экзонуклеаз и способствуют ее контакту с хромосомой, а затем рекомбинации с ней. На этом процесс трансформация завершается.

ДНК можно ввести в бактерии также искусственно. Для этого, например, бактерии кишечной группы (для них естественная трансформация не характерна) охлаждают и обрабатывают растворами СаСl2 или RbCl либо подвергают замораживанию при низких температурах с последующим оттаиванием. Клетки при этом становятся проницаемыми для ДНК, однако механизм трансформация в этом случае совершенно иной, чем описанный выше.

В бактерии посредством трансформация можно ввести также ДНК плазмид. Конечным результатом этого является возникновение клетки, несущей чужеродную плазмиду в автономном состоянии или включенную в состав хромосомы. Механизм проникновения в клетку плазмидной ДНК такой же, как и хромосомной. Однако возникновение однонитевой ДНК и др. процессы, сопутствующие поглощению, настолько "уродуют" плазмиды, что вероятность правильного восстановления кольцевой реплицирующейся формы низка (трансформация клетки мономерными формами плазмид не эффективна). Поэтому употребляют мультимерные (состоящие из неск. плазмид) формы или плазмиды с прямыми повторами нуклеотидов, отчего шансы на "сборку" полноценной плазмиды повышаются.

С помощью плазмид можно также осуществить трансформация протопластов (клетки с удаленной клеточной стенкой), которые затем регенерируют в полноценные клетки. ДНК, проникая в них, почти не повреждается и остается двунитевой. Плаз-мидная трансформация во многом близка к трансформация наз. трансфекции, когда бактерии поглощают ДНК фага (вирус бактерий), предварительно выделенную из фаговых частиц. Эта ДНК в бактерии кодирует образование новых частиц фага, которые разрушают затем бактериальную клетку и выходят наружу.

трансформация у дрожжей м. б. осуществлена только искусственным путем. Для этой цели используют протопласты или обрабатывают клетки солями щелочных металлов. ДНК проникает в дрожжевые протопласты также под действием электрич. разрядов (трансформация наз. электропорация).

трансформация клеток млекопитающих осуществима только искусственно в результате микроинъекций чужеродной ДНК в ядра эмбрионов, соматич. клеток или путем поглощения ДНК клетками в культуре тканей. Чаще всего ДНК добавляют к смеси раствора СаСl2 и фосфатного буфера; образуется мелкодисперсный осадок, который адсорбируется и поглощается клетками. Возможно также введение ДНК в липосоме или путем использования в качестве переносчика ДНК-содержа-щего умеренного вируса с включением в его геном фрагментов ДНК животных.

Клетки растений не способны поглощать ДНК. При трансформация клеток двудольных растений используют регенерирующие протопласты, поглощающие свободную ДНК и ДНК, заключенную в липосомы. Регенерирующие трансформированные протопласты образуют трансформация наз. каллусную ткань, из которой затем формируется растение. Др. способом введения чужеродной ДНК в геном таких раститрансформация клеток является естественное заражение их бактерией Agrobacterium tume-faciens, несущей Ti- или Ri-плазмиды. Эта бактерия способна проникать в интактные раститрансформация клетки, и освобождающиеся затем плазмиды встраиваются в геном. У однодольных растений эти плазмиды не функционируют в клетке, для их трансформация прибегать к прямому переносу ДНК в протопласты, используя электропорацию. трансформация растений можно осуществлять также путем "выстрела" в клетку ускоренными частицами вольфрама или золота, на которые предварительно нанесена ДНК.

трансформация используют в генетической инженерии для введения в клетку генов, несущих заданную информацию.

трансформация впервые была открыта в 1928 Ф. Гриффитом. В 1944 О. Эвери с сотрудниками показал, что превращение некоторых непатогенных бактерий в патогенные осуществляется в результате переноса в геном первых ДНК, высвобождающейся из клеток вирулентных штаммов.

9. Трансформация — процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. Иногда под трансформацией понимают любые процессы горизонтального переноса генов, в том числе трансдукцию, конъюгацию и т. д.

Трансформация у прокариот[править | править вики-текст]

В любой популяции лишь часть бактерий способна к поглощению из среды молекул ДНК. Состояние клеток, при котором это возможно, называют состоянием компетентности. Обычно максимальное число компетентных клеток наблюдается в конце фазы логарифмического роста.

В состоянии компетентности бактерии вырабатывают особый низкомолекулярный белок (фактор компетентности), активизирующий синтез аутолизина, эндонуклеазы I и ДНК-связывающего белка. Аутолизин частично разрушает клеточную стенку, что позволяет ДНК пройти через неё, а также снижает устойчивость бактерий к осмотическому шоку. В состоянии компетентности также снижается общая интенсивность метаболизма. Возможно искусственное приведение клеток в состояние компетентности. Для этого применяют среды с высоким содержанием ионов кальция, цезия, рубидия, электропорацию или заменяют клетки реципиента протопластами без клеточных стенок.

Эффективность трансформации определяется количеством колоний, выросших на чашке Петри после добавления к клеткам 1 мкг суперскрученной плазмидной ДНК и рассева клеток на питательную среду. Современные методы позволяют добиваться эффективности 106—109.

Поглощаемая ДНК должна быть двухнитевой (эффективность трансформации однонитевой ДНК на порядки ниже, однако несколько возрастает в кислой среде), её длина — не менее 450 пар оснований. Оптимальный pH для прохождения процесса — около 7. Для некоторых бактерий (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus) поглощаемая ДНК должна содержать определённые последовательности.

ДНК необратимо адсорбируются на ДНК-связывающем белке, после чего одна из нитей разрезается эндонуклеазой на фрагменты длиной 2—4 тыс. пар оснований и проникает в клетку, вторая полностью разрушается. В случае, если эти фрагменты имеют высокую степень гомологии с какими-либо участками бактериальной хромосомы, возможна замена этих участков на них. Поэтому эффективность трансформации зависит от эволюционного расстояния между донором и реципиентом. Общее время процесса не превышает нескольких минут. Впоследствии, при делении, в одну дочернюю клетку попадает ДНК, построенная на основе исходной нити ДНК, в другую — на основе нити с включённым чужеродным фрагментом (выщепление).

Трансформация у эукариот[править | править вики-текст]

Трансформация эукариотических клеток с использованием синтетических полимерных катионов

Доставка чужеродных нуклеиновых кислот внутрь интактных клеток, или трансформация, лежит в основе многих методов генной инженерии. Транспортировка функциональных генов в ткани может сделать возможной коррекцию генной недостаточности и мутаций, следствием которых являются тяжелые наследственные патологии или раковые опухоли. В настоящее время разработан целый ряд приемов для введения ДНК в клетки, среди которых наиболее распространены преципитация фосфатом кальция или диэтиламиноэтил-декстраном (ДЕАЕ-декстраном), электропорация, микроинъекция, встраивание ДНК в реконструированную оболочку вирусов или липосомы (искусственные мембранные липидные везикулы).

Несмотря на разнообразие этих методов, поиск новых путей трансформации про- и эукариотических клеток продолжается. С одной стороны, это вызвано необходимостью повышения эффективности трансформации, с другой – перечисленные выше методы применимы лишь для ограниченного числа клеточных линий и неэффективны при попытках введения в клетки РНК. Наконец, большинство этих подходов не может быть использовано для генетической трансформации in vivo.

В качестве переносчиков ДНК используются ретровирусные векторы, векторы на основе ДНК-содержащих вирусов и ВИЧ, липосомы на основе катионных липидов, полимерные ДНК-связывающие катионы. Использование синтетических полимеров в качестве переносчиков ДНК имеет ряд преимуществ: удобство хранения и очистки, простота тестирования токсичности и безопасности и, что особенно важно для генной терапии, снижение риска патогенетических и иммунологических осложнений.

При смешивании растворов линейных поликатионов и ДНК формируются интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК) за счет образования кооперативной системы межцепных электростатических связей. При этом поликатионные цепи окружают молекулу ДНК, образуя сферы или тороиды, в зависимости от типа полимера. Включение в ИПЭК приводит к компактизации ДНК, повышению её устойчивости к действию нуклеаз, способствует усилению её взаимодействия с клеточной мембраной и повышению трансформирующей активности по отношению как к прокариотическим, так и эукариотическим клеткам. Соединяя молекулы поликатиона с лигандами, способными к специфическому связыванию с клеточной мембраной, можно обеспечить проникновение ИПЭК в клетку по рецепторному пути, а в организме – адресную доставку к клеткам-мишеням.

Системы доставки ДНК для применения в генной терапии должны обеспечивать проникновение ДНК в нужный орган, ткань, или в конкретную группу клеток, а затем – в клеточное ядро. Антисмысловые олигонуклеотиды, а именно они чаще всего используются в генной терапии, должны найти ту мРНК или участок хромосомной ДНК, против которой они направлены. Введенный ген должен войти в состав конструкции, способной его экспрессировать.

Однако это довольно сложная проблема. При введении нуклеиновой кислоты или олигонуклеотида в организм они не попадут преимущественно к нужной ткани или нужному органу, а та их часть, которая окажется в нужном месте, лишь в незначительной мере сможет пройти сквозь гидрофобную клеточную мембрану. Кроме того, в ходе эволюции были выработаны механизмы защиты клеток организма от вторжения факторов внешней среды, в том числе и чужеродной ДНК. Оказавшись внутри клетки, чужеродная ДНК может локализоваться не там, где это необходимо и, более того, может оказаться в лизосомах, где будет разрушена под действием нуклеаз.

Проникновение в клетку и внутриклеточный транспорт ИПЭК происходит, возможно, за счет образования и последовательного разрушения эндосом. На каждом из этапов этого процесса существенная часть материала теряется. Скудное высвобождение векторов из эндосом в цитоплазму и неэффективный перенос их в ядро приводят к низкой эффективности трансгенной экспрессии.

Можно выделить три пути повышения эффективности переноса ДНК в эукариотические клетки с помощью синтетических поликатионов. Во-первых, это повышение специфичности трансфекции* за счет лигандов, соединенных с молекулой поликатиона и обеспечивающих избирательное взаимодействие комплексов с клетками определенного фенотипа. Во-вторых – повышение эффективности трансформации за счет подбора генов или олигонуклеотидов, внедряемых в клетку. В-третьих – повышение частоты трансфекции, которое достигается за счет применения лигандов, более эффективно взаимодействующих с клеточной мембраной, и веществ, дестабилизирующих мембрану. Кроме того, возможен синтез новых поликатионов.

В лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа РАМН в Санкт-Петербурге проводится изучение средств доставки ДНК и вирусных частиц в клетки. В этой работе используется набор полимерных носителей, синтезированный сотрудниками Института высокомолекулярных соединений РАН. В качестве экспрессионных векторов использовались плазмиды: pUC 18, содержащая цитомегаловирусный промотор и ген b-галактозидазы, и pBR 322, содержащая цитомегаловирусный промотор и ген зеленого флуоресцирующего белка водорослей.

В результате проведенных исследований было выяснено, что наибольшую трансфекционную активность имеют ИПЭК поли-(2-(диметиламино)этил)метакрилата (PDMAEMA) с низкими молекулярными массами. Дальнейшие исследования позволят разработать новые подходы к решению актуальных проблем в вирусологии, молекулярной и клеточной биологии, генной инженерии, генной терапии.

Трансфекция – передача всего набора генов вируса или фага, приводящая к развитию вирусных частиц в клетке.