4. Определение массовой доли белка методами уф-спектрофотометрии

4.1. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА В ГОВЯДИНЕ

Порядок проведения анализа. Образец массой 15 г гомогенизи­руют с 250 см³ раствора лимонной кислоты молярной концентра­цией 0,1 моль/дм³ в гомогенизаторе в течение 2—3 мин.

К гомогенизированной порции (в пробирке) прибавляют 9,5 см³ раствора мочевины молярной концентрацией 8 моль/дм³ в растворе гидроксида натрия молярной концентрацией 2 моль/дм³, встряхивают, центрифугируют при частоте вращения 83 с"¹ в тече­ние 7 мин для отделения жира и измеряют оптическую плотность при X = 243 нм.

Массовую долю белка определяют, используя калибровочный график или уравнение регрессии, для чего предварительно опре­деляют массовую долю белка по методу Кьельдаля.

Уравнение регрессии, например, для соленой говядины име­ет вид

у= 17,32л: + 1,025, (1.8)

где у — массовая доля белка, %; л — оптическая плотность (х= D при X = 243 нм).

4.2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА В МЯСЕ ПТИЦЫ

Порядок проведения анализа. При определении массовой доли белка в курином мясе методами УФ-спектрофотометрии предварительно тщательно измельченный образец массой 1,5 г суспендируют в гомогенизаторе в течение 5 мин со 100 см³ раст­вора лимонной кислоты, затем с помощью пипетки вносят 0,5 см³ суспензии в центрифужную пробирку, добавляют 9,5 см³ раствора карбамида, содержащего гидроксид натрия, и после осторожного перемешивания центрифугируют в течение 3 мин при частоте вращения 116—117 с^-'. Заполняют кварцевую кю­вету с толщиной светопоглощаюшего слоя 1 см прозрачной жидкостью и измеряют оптическую плотность на спектрофото­метре при X = 241 нм.

В качестве контрольного раствора используют смесь из 0,5 см³ раствора лимонной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм³ и 9,5 см³ щелочного раствора мочевины.

Массовую долю белка определяют, используя калибровочный график или приведенное выше уравнение регрессии (1.8). Пробы с различной массовой долей белка рекомендуется готовить путем смешивания гомогенизированного куриного мяса со свиным жи­ром в различных соотношениях.

67

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА В СВИНИНЕ И ГОВЯДИНЕ

Порядок проведения анализа. Анализ проводится по той же ме­тодике (см. п. 4.2). но с использованием других длин волн и дру­гих калибровочных графиков. Возможно также использование уравнений регрессии: для свинины

v=-13.7282 + 63.8762*:

(1.9)

ДЛЯ говядины

>• = 6,9999 + 34,8326х

(1.Ю)

Результаты определения массовой доли белка в объектах иссле­дования с использованием метода Лоури, биуретового метода и метода связывания красителей белками рекомендуется оформить в виде таблицы, форма которой приведена ниже.

Объект исследования

Оптическая плотность раствора

Концентрация азота по калибровочному графику, мкг/см'

Массовая доля белка в образце, %

Результаты определения массовой доли белка в объектах иссле­дования с использованием методом УФ-спектрофотометрии реко­мендуется свести в таблицу:

Объект исследования (наименование образца)	Оптическая плотность раствора	Массовая доля белка, %

По результатам предварительной теоретической подготовки и проведенных определений делают выводы и составляют об­щее заключение по работе. На базе литературных данных и ре­зультатов собственных исследований рекомендуется дать срав­нительную характеристику сырья и продуктов по содержанию белка, а также прокомментировать преимущества и недостатки предлагаемых модификаций фотометрических методов анализа белков мяса и мясопродуктов.

68

Лабораторная работа № 3

АНАЛИЗ ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ ИХ РАСТВОРИМОСТИ

Цель работы. Определить фракционный состав белков мяса и мясопродуктов на основе их способности к растворению.

Задачи. Провести предварительное выделение фракций метола- ми экстракции и количественно определить белки в экстрактах.

Объекты исследования. Мышцы различных видов животных (говядина, свинина, баранина) аналогичных анатомических участ­ков, образцы соединительнотканных образований и внутренних органов.

Материалы, реактивы и оборудование. Дистиллированная вода; солевой раствор Вебера; раствор гидроксида натрия массовой долей 10%; сывороточный альбумин; биуретовый реактив; фото- электроколориметр (ФЭК-56М); настольная центрифуга; часовое стекло; пипетки; пробирки; технические весы; мерные цилиндры вместимостью 10 см³.

Приготовление реактивов. Биуретовый реактив. 1,5 г CuS0₄ 5Н₂0 и 6,0 г NaKC₄H₄0₆ • 4Н₂0 растворяют в 500 см³ воды, при постоянном перемешивании добавляют 300 см³ раство­ра гидроксида натрия массовой долей 10 %. Общий объем доводят дистиллированной водой до 1000 см³.

Методические указания. Белки мяса и мясопродуктов можно разделить на растворимые в воде (белки саркоплазмы), в солевых растворах (белки миофибрилл) и нерастворимые в водно-солевых растворах, условно называемые белками стромы.

Водорастворимые белки саркоплазмы включают миоген, мио­глобин (природный пигмент), миоальбумин, глобулин X.

К солерастворимым (миофибриллярным) белкам относятся миозин, актин, тропомиозин, тропониновый комплекс.

Фракция стромы включает белки, входящие в состав сарколем­мы и внутримышечной соединительной ткани, которая связывает мышечные волокна в пучки, а также белки ядер. Фракция стромы объединяет белки: коллаген, эластин, ретикулин, а также глико- протеиды — муцины и мукоиды. Последние представляют собой слизистые белки, выполняющие защитные функции и облегчаю­щие скольжение мышечных пучков. Все эти белки можно извлечь щелочными растворами. На практике их часто называют щелоче- растворимой белковой фракцией мышечной ткани.

Количественное соотношение различных фракций, их состоя­ние определяют не только технологические свойства сырья и про­дуктов, но и их биологическую ценность.

Для анализа белковых веществ используют много методов, включая различные модификации метода Кьельдаля, фотометри­ческие методы с использованием спектрофотометров и фотоэлек- троколориметров.

69

Среди ускоренных фотометрических методов большое призна­ние получила бпуретовая реакция, достоинства которой уже были отмечены в лабораторной работе № 2 при анализе белков.

На основе информации о количественном соотношении белко­вых фракций можно провести реальное прогнозирование функци­онально-технологических свойств сырья, особенно при получе­нии продуктов заданного качества.

Подготовка проб к анализу. Мышцы различных животных (го­вядина, свинина, баранина) аналогичных анатомических участков тщательно освобождают от жира и прирезей соединительной тка­ни. Навеску массой 3—4 г тщательно измельчают ножом на часо­вом стекле. К навеске измельченного сырья приливают дистилли­рованную воду в соотношении 1 : 6 (по массе) и ведут экстракцию на холоде при О "С в течение 30 мин. Затем центрифугировани­ем при частоте вращения 83 с^-1 в течение 5 мин отделяют осадок. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и используют для количественного определения белков.

Осадок количественно переносят в фарфоровую ступку, расти­рают с песком и приливают солевой раствор Вебера в соотноше­нии 1 : 6 к первоначальной навеске мышечной ткани. Экстракцию проводят при 0 °С в течение 20 мин. По истечении указанного вре­мени экстракт отделяют центрифугированием в течение 10 мин при частоте вращения 83 с^-1. Надосадочную жидкость декантиру­ют и используют для количественного определения солераствори- мых белков, а осадок подвергают обработке.

Далее осадок количественно переносят в термостойкую про­бирку, добавляют 10 см³ раствора гидроксида натрия массовой долей 10 % и нагревают на водяной бане температурой до 96 °С. Полученный раствор после охлаждения центрифугируют при частоте вращения 83 с^-1 в течение 5 мин. Надосадочную жид­кость декантируют и используют для количественного определе­ния белков стромы.

Порядок проведения анализа. Для проведения цветной реак­ции к 1 см³ исследуемых растворов белков (фракции: водораство­римая, солерастворимая и щелочерастворимая) добавляют 4 см³ биуретового реактива. Смесь оставляют в покое при температуре (20 ± 5) °С в течение 30 мин. По истечении времени образования окрашенного комплекса измеряют оптическую плотность раство­ра при длине волны 540—560 мкм на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром.

Для того чтобы определить содержание белка в любой из фракций мышечной ткани, нужно снять показания оптической плотности D_v найти это значение на оси ординат калибровоч­ного графика и определить соответствующую концентрацию на оси абсцисс. Построение калибровочного графика — см. лабо­раторную работу № 2.

70

Массовую долю воло-, соло- и щелочерас гворимых белковых фракций (^сс) определяю!- по формуле

Л'= 100(с У)/т. (1.11)

где с — концентрация белка, найденная по калибровочном} графику. мг/см-': Г— объем пробы после экстрагирования соответствующей белковой (фракции, см': _ масса нанескн мышечной ткани, мг.

Подготовив образцы мышечной ткани определенного вида жи­вотных, проведя фракционирование, измерив оптическую плот­ность, выполняют расчеты и оформляют результаты в виде таблицы:

водорастворим ы>		Содержание белков солерастворимых		шелочераствори мы.х	Всею
,\п/г	%	М|/г		Ml/г 1 % ' 1	мг/г	Гс
				|

После заполнения таблицы рекомендуется проанализировать данные дня мяса от одного и ог нескольких видов животных, раз­личных тканей и сформулировать заключение по данной работе.

Лабораторная работа № 4 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТОМИОЗИНА

Цель работы. Приобрести практический навык количественно­го анализа белков актомиозинового комплекса в образцах мышеч­ной ткани различных видов убойных животных и птицы.

Задачи. Экстрагировать солерастворимую белковую фракцию мышечной ткани, осадить белки, гравиметрически определить и рассчитать массовую долю актомиозинового комплекса.

Объекты исследования. Образцы мышечной ткани одного или различных видов убойных животных и птицы на различ­ных стадиях автолиза, полученные от аналогичных анатомичес­ких участков.

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор Вебера; ацетат­ный буферный раствор (рН 4,8); раствор СН₃СООН массовой долей 1%; сушильный шкаф; лабораторный потенциометр — рН-метр; весы аналитические; стаканчик для титрования; без­зольные фильтры; ступка охлажденная.

Методические указания. Количественное соотношение различ­ных белковых фракций мышечной ткани характеризует степень и глубину автолитических превращений. С одной стороны, коли­чественное содержание актомиозина свидетельствует о степени

71

трупного окоченения, ограничивающею применение мясного сы­рья. с другой лае г информацию о необходимое! и использова­ния дополнительных средств, расширяющих его технологические возможности.

В свежей мышечной ткани растворимость миофибриллярных белков максимальна, поскольку актин и миозин существуют в виде отдельных фракций. Мышца в результате этого расслабле­на, имеет высокую гидрофильность. С развитием автолитических процессов в период посмертного окоченения актин и миозин об­разуют комплекс, и мышца укорачивается, теряет влагу.

Актомиозин, извлекаемый из мышцы солевыми растворами, выпадает в осадок при диализе или разведении экстрактов, имеет изоэлектрическую точку при рН 5,5 и составляет около 55 % всех белков мышцы.

Количественное соотношение различных фракций, их состоя­ние во многом определяют как технологические свойства сырья, так и его биологическую ценность.

Миофибриллярные белки мышечной ткани на различных ста­диях автолиза определяют по методу Баленовича — Штрауба. Бел­ки актомиозинового комплекса осаждают из супернатанта соле­растворимых белков, полученных при экстрагировании навески ткани раствором Вебера путем снижения молярной концентрации хлорида калия до 0,05—0,06 моль/дм³ при определенных значени­ях рН раствора.

Для снижения молярной концентрации солей применяется десятикратное разведение супернатанта охлажденной до 0 °С дистиллированной водой.

Подготовка проб к анализу. Навеску мышечной ткани массой 3—4 г тщательно измельчают ножом на часовом стекле. К навеске измельченного сырья добавляют дистиллированную воду в соот­ношении 1 : 6 (по массе) и ведут экстракцию на холоде при 0 °С в течение 30 мин. Затем центрифугированием при частоте вращения 83 с^-1 в течение 5 мин отделяют осадок. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и удаляют.

Осадок количественно переносят в фарфоровую ступку, расти­рают с песком и добавляют солевой раствор Вебера в соотноше­нии 1 : 6 к первоначальной навеске мышечной ткани. Экстракцию проводят при 0 °С в течение 20 мин. По истечении указанного вре­мени экстракт отделяют центрифугированием в течение 10 мин при частоте вращения 83 с^¹. Надосадочную жидкость декантиру­ют и используют для количественного определения актомиозино­вого комплекса миофибриллярных белков.

Порядок проведения анализа. 1. Для снижения концентрации солей в экстракте белков солерастворимой фракции к их экстрак­ту объемом 2 см³ добавляют дистиллированную воду температурой 0 °С в соотношении 1 : 9.

72

2. Исследуют две зоны осаждения белков актомиозинового комплекса: при рН 5,2 и 7,0.

В первом случае к разведенному раствору добавляют из рас­чета на каждый 1 ем³ экстракта солерасгворимых белков (в дан­ном случае 2 см³) по 0,5 см³ ацетатного буфера рН 4,8, контро­лируя и доводя рН раствора по лабораторному потенциомет­ру — рН-метру до 5,2.

Во втором случае разведенный охлажденной дистиллирован­ной водой раствор центрифугата осторожно по каплям нейтрали­зуют раствором уксусной кислоты массовой долей 1 %, доводя рН раствора по потенциометру — рН-метру до 7,0.

Осажденный актомиозин после некоторого уплотнения в раст­воре при отстаивании на холоде отделяют фильтрованием через предварительно высушенный до постоянной массы и взвешенный с точностью до 0,0001 г фильтр. Массу осадка определяют после его высушивания на фильтре при 105 °С до постоянной массы.

Массовую долю фракции актомиозина (%) рассчитывают по формуле

Х= 100[(/w, - m_Q)V}/2m, (1.12)

где /и, — масса фильтра с сухим остатком, г; т₀ — масса высушенного филь­тра, г; V — объем раствора Вебера, добавленный для экстрагирования, см³; 2 — объем экстракта белка, взятый для осаждения, см³; т — масса навески образца ткани, г.

Полученные экспериментальные и расчетные данные офор­мляют в виде таблицы:

Образец	Сроки и условия хра­нения (при исследо­вании образцов мы­шечной ткани на раз­ных стадиях автолиза)	Массовое содержание актомиозиновой фракции
		мг/г	%

По результатам проведенных определений делают выводы и формулируют общее заключение по работе.

Лабораторная работа № 5 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА

Цель работы. Приобрести навык в определении количествен­ного содержания коллагеновых белков в образцах различных ви­дов тканей убойных животных и птицы.

Задачи. Экстрагировать коллаген и количественно определить его на основе минерализации, а также путем гидролиза коллагено-

73

ных полипепшдов с последующим проведением качественной реакции на оксипролин и фотометрпрованием.

Объекты исследования. Образцы мышечной и соединительно!! ткани убойных животных и птицы.

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор соляной кис­лоты молярной концентрацией 12 моль/дм³: хлорид олова (II); растворы гидроксида натрия молярной концентрацией 2,5 и 6 моль/дм³; насыщенный раствор карбоната натрия; раствор суль­фата меди молярной концентрацией 0,01 моль/дм³; раствор пе- роксида водорода массовой долей 6 %; раствор серной кислоты молярной концентрацией 3 моль/дм³; раствор я<://?с/-ди метилам и - нобензальдегида в пропиловом спирте массовой долей 5 %; спир­товой раствор фенолфталеина массовой долей 1 %, растворы гид­роксида натрия массовой долей 0,1 и 0,2 %; раствор уксусной кис­лоты массовой долей 20%; лед; универсальный индикатор; бу­мажные фильтры; вата; воронка Бюхнера; водяная баня; ступки фарфоровые; центрифуга лабораторная; центрифужные пробир­ки; стеклянные стаканы; стеклянные колбы вместимостью 100 и 200 см³; установка для минерализации проб; колба Кьельдаля со шлифом из стекла пирекс или молибденового; обратный шарико­вый холодильник; колбонагреватель; стеклянные ампулы; стек­лянные палочки; пластинка из молочно-белого стекла; спектро­фотометр или фотоэлектроколориметр; автоклав.

Методические указания. Количественное определение колла­гена в животных тканях проводят либо по методу В. П. Воло- винской, основанному на экстрагировании фракции коллагено- вых белков и последующем определении в экстрактах белкового азота (см. лабораторную работу № 1), либо по количественному содержанию аминокислоты оксипролина, специфической для коллагена (см. лабораторную работу № 10). Метод основан на предварительном гидролизе коллагеновых полипептидов с по­следующим проведением качественной цветной реакции на ок­сипролин и фотометрированием. Включает следующие основ­ные операции: гидролиз ткани соляной кислотой в присутствии хлорида олова, нейтрализацию кислоты и удаление олова, окис­ление оксипролина, развитие цветной реакции с яярд-диметил- аминобензальдегидом, измерение интенсивности окраски фото­метрированием.

Результаты, полученные по этому методу, приведены в табл. 1.11.

Расчет количества белка ведут на основании известного мас­сового содержания оксипролина (23 % к сумме аминокислот) в коллагенах.

Для выделения оксипролина мышечную ткань подвергают гид­ролизу с применением кислоты или щелочи. Продолжительность гидролиза имеет большое значение: недостаточная приводит к не­полному освобождению оксипролина, а избыточная — к частич­ному его разрушению.

74

Та 6 липа I.!

Массовая доля (%) оксипролина и соединительнотканных белков

в разных вилах тканей

Образен

Оксипролин

Поясничная мышца свиней

Шейная часть туши крупного рога­того скота

Филей крупного рогатого скота Сырые связки убойных животных

0.046 0.322

0.220 10.56

Соединительнотканные белки

0.371 2.600

1,800 85.200

Добавление хлорида олова II (не менее 3/4 количества белка в навеске) необходимо для предотвращения образования гумино- вых веществ.

При нейтрализации и подщелачивании гидролизата используют карбонат натрия, чтобы предотвратить образование ионов олова в щелочной среде и облегчить его удаление в виде гидрата олова.

Окисление оксипролина пероксидом водорода в щелочной сре­де приводит к образованию продуктов, дающих с яя/ю-диметил- аминобензальдегидом цветную реакцию. Следы пероксида водо­рода могут понизить интенсивность окраски или придать раствору неспецифический оттенок, поэтому его избыток разрушают на­греванием на водяной бане при 80 "С. При этом рекомендуется до­бавлять мочевину, образующую довольно стойкое соединение с пероксидом водорода C0(NH₂)₂H₂0₂.

Интенсивность образовавшейся розовой окраски измеряют спектрофотометрически или колориметрически. Окраска устой­чива к течение 60—90 мин. В пределах до 25 мкг оксипролина по­глощение подчиняется закону Бугера—Ламберта—Бера. Специ­фичность реакции очень высока.

Из всех аминокислот, содержащихся в кислотном гидролизате белков мяса, определению мешает только тирозин. По данным Е. Вербицкого и Ф. Е. Деасраджа, окраска тирозина составляет 1,3 % окраски, развиваемой оксипролином. Поэтому используется поправка на тирозин — 0,072 единицы оптической плотности на 1 см³ кислотного гидролизата, соответствующего 40 мг мяса:

0 3 1 3 0 928

hii ■ 40 000 = 0,072.

20 100 100

Полная поправка с учетом окраски самого гидролизата, соот­ветствующей 0,01 ±0,003, составляет 0,082 единицы оптической плотности на 40 мг мяса в 1 см³ гидролизата.

75

Для проведения цветной реакции в зависимости от ожидаемого содержания соединительной ткани в продукте следует брать разные объемы испытуемого раствора. Если, например, на анализ взяга препарированная длиннейшая спинная мышца свиньи, то объем ис­следуемого раствора может быть равен 1 см³ (при разведении гидро­лизата до 100 см³). Массовая доля соединительной ткани в указан­ной мышце составляет 0,2—0.4 9с. Если же взят образец, содержа­щий больше соединительной ткани, то на цветную реакцию нужно значительно меньше испытуемого раствора. Объем раствора дово­дят до 1 см³ дистиллированной водой.

Подготовка проб к анализу. Ткани животных предварительно режут на маленькие кусочки и взвешивают согласно нижепри­веденным рекомендациям в соответствии с принятым методом определения.

1.ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА В МЯСЕ ПО МЕТОДУ В. П. ВОЛОВИНСКОЙ

Порядок проведения анализа. Измельченный образец ткани массой Ю г растирают с 50 см³ раствора хлорида натрия массо­вой долей 0,6 %. Полученную смесь переносят в центрифужную пробирку, ополаскивая ступку и пестик 50 см³ того же раствора. Смесь экстрагируют в течение I ч, затем центрифугируют в те­чение 15 мин при частоте вращения 33—50 с^-1. Жидкую фрак­цию удаляют, а к осадку прибавляют 100 см³ раствора гидрокси­да натрия массовой долей 0,2 %. Через 12—24 ч после тщатель­ного перемешивания жидкую фракцию отделяют центрифуги­рованием. Остаток ткани обрабатывают щелочью еще 2 раза, каждый раз добавляя по 50 см³ раствора гидроксида натрия мас­совой долей 0,2 %.

Остаток ткани из пробирки количественно переносят в стакан, смывая раствором гидроксида натрия массовой долей 0,1 % (объем раствора гидроксида натрия 100 см³). Содержимое стакана нагре­вают при умеренном кипении в течение 30 мин, по возможности сохраняя объем жидкости в стакане периодическим добавлением горячей воды. Затем частицам ткани дают возможность осесть на дне стакана и в горячем виде жидкость осторожно декантируют с осадка в мерную колбу вместимостью 200 см³ через воронку с не­большим количеством ваты, предварительно проверенной на со­держание азота.

Остаток в стакане вместе с ватой, через которую проводилось фильтрование, при кипении обрабатывают водой, для чего в стакан наливают 100 см-³ горячей дистиллированной воды и при умерен­ном кипении раствор сгущают за 1,5—2,0 ч до 1/3 первоначального объема. Сгущенный раствор через 15—20 мин декантируют с осадка через вату в ту же мерную колбу вместимостью 200 см³.

76

Аналогично при кипении остатки ткани обрабатывают водой еше два раза. После последней экстракции вату промывают водой и промывные воды присоединяют к общему объему экстракта.

Собранный в мерную колбу экстракт подкисляют раствором уксусной кислоты массовой долей 20 % до рН 4,8. нагревают до 50 °С и после охлаждения доводят водой до метки. При подкисле- нии выпадает небольшое количество белков, от которых освобож­даются фильтрованием через бумажный фильтр. Из фильтра берут 20 см³ и после минерализации определяют азот согласно описа­нию лабораторной работы № 1.

Массовую долю азота в коллагене (%) вычисляют по формуле

N = (а ■ 200 ■ 1 00)/(20/7Z), (1.13)

где а — массовая доля азота в 20 см³ фильтрата. %: т — масса навески ткани, г.

Коэффициент пересчета азота на коллаген равен 5,62.

2.ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА НА ОСНОВЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО ГИДРОЛИЗА

Порядок проведения анализа. Навеску мяса массой 4 г вносят в колбу Кьельдаля вместимостью примерно 100 см³ со шлифом для присоединения обратного холодильника. К навеске добавляют 7см³ воды, 10см³ соляной кислоты молярной концентрацией 12 моль/дм³ и 0,7 г хлорида олова (II).

К колбе присоединяют пришлифованный шариковый холо­дильник и включают воду. Нагревание ведут на воздушной или песчаной бане. Для воздушной бани удобно использовать колбо- нагреватель (электроплитку с коническим углублением). С мо­мента закипания жидкость нагревают ровно 7 ч, после чего плитку выключают и отставляют от колбы. Еще теплую колбу отсоединя­ют от холодильника и содержимое переносят, смывая дистиллиро­ванной водой, в мерную колбу вместимостью 100 см³. Исходную колбу несколько раз ополаскивают водой (общий объем промыв­ных вод должен быть не более 2/3 объема колбы).

Для ускорения процесса гидролиз проводят в автоклаве. Навес­ку мяса массой 4 г вносят в ампулу вместимостью 25 см³ через рас­ширенную часть горлышка (обрезают запаянный конец пустой ампулы так, чтобы образовалась воронка). К навеске добавляют 7 см³ воды, 10 см³ концентрированной соляной кислоты и 0,7 г хлорида олова (II). Ампулы запаивают на горелке и помещают в автоклав температурой 112—114 °С на 3,5 ч, после чего их можно хранить длительное время.

Содержимое ампулы переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, остатки смывают дистиллированной водой (общий объем промывных вод должен быть не более 2/3 объема колбы).

77

Содержимое мерной колбы независимо от способа гидролиза нейтрализуют раствором гидроксида натрия молярной концентра­цией 6 моль/дм\ а затем доводят насыщенным раствором карбо­ната натрия до рН 8,0—8.2. После образования белого осадка на­чинают контролировать рН. используя рН-метр со стеклянным электродом или универсальный индикатор и фенолфталеин.

При работе по последнему способу из колбы отбирают тонкой стеклянной палочкой одну каплю жидкости и помещают ее на пластинку из молочно-белого стекла. Добавляют несколько ка­пель дистиллированной воды и одну каплю универсального инди­катора. После того как по универсальному индикатору рН жидко­сти будет близок к 7,5. добавляют несколько кубических санти­метров раствора карбоната натрия. Обработка считается закончен­ной, если капля раствора, смешанная с водой, окрасится в чуть заметный розовый цвет (по фенолфталеину).

Колбу с жидкостью быстро охлаждают, объем доводят до метки дистиллированной водой и оставляют в покое в течение 30 мин. Затем осадок отфильтровывают через плотный бумажный фильтр на воронке Бюхнера при слабом разрежении.

Если фильтр мутный, его вторично фильтруют через тот же са­мый фильтр. Фильтрат светло-желтого цвета должен быть совер­шенно прозрачным. Одновременно гидролизуют, а затем нейтра­лизуют и фильтруют несколько проб.

В пробирки отмеряют пипетками по 1 см³ растворов в указан­ном порядке: исследуемый фильтрат, раствор сульфата меди мо­лярной концентрацией 0,01 моль/дм³, раствор гидроксида натрия молярной концентрацией 2,5 моль/дм^, раствор пероксида водо­рода массовой долей 6%. Одновременно проводят три конт­рольных опыта, в которых исследуемый фильтрат заменяют 1 см³ дистиллированной воды.

Растворы в пробирках перемешивают, периодически встряхи­вая, в течение 5 мин. Затем пробирки помещают на водяную баню при 80 °С на 5 мин, часто и энергично встряхивая их. При этом про­бирки должны быть глубоко погружены в воду. По окончании на­гревания пробирки охлаждают на водяной бане со льдом и добавля­ют в каждую при перемешивании 4 см³ раствора серной кислоты молярной концентрацией 3 моль/дм³, а затем при сильном переме­шивании 2 см³ раствора яд/?я-диметиламинобензальдегида.

Далее пробирки помещают на водяную баню при 70 °С на 16 мин, после чего охлаждают водопроводной водой (под краном) и измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 560 нм или фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром. Измерения сравнивают с контрольным опытом. Предварительно измеряют оптическую плотность двух конт­рольных растворов (одного относительно другого). Третий конт­рольный раствор служит запасным, его используют только в слу­чае расхождения в показаниях первых двух растворов.

78

Построение калибровочного

графика. Рас 1 норы оксипролина концентрацией 0.25.0 мкг /см подвергают всем операциям со­гласно описанию метода, на­чиная с гидролиза, так как в процессе последнего некоторое количество оксипролина разру­шается (рис. 1.23).

По калибровочному графику находят концентрацию окси­пролина в объеме жидкости, находящейся в пробирке после добавления /ш/м-диметиламино- бензальдегида (10 см^?).

Массовую долю оксипроли­на в исследуемом образце (мг%)

D

0.4 г

Рис. 1.23. Калибровочный график для определения оксипролина:

/ - без гидролиза; 2 -- после кислотною гидроли sa

ассчитывают по формуле

_v с 100 100

X = (1.14)

где с — концентрация оксипролина J3 10 см³ окрашенного раствора, определенная по калибровочному графику, мг; 100 — объем раствора, полученный после ней­трализации. см³; 100 — множитель для перевода в проценты; V— объем раствора, взятый для цветной реакции, см³; т — масса навески мяса, г.

Предварительно из величины оптической плотности, отнесен­ной к 1 см³ гидролизата, соответствующего 40 мг мяса, вычитают поправку, равную 0,082 единицы оптической плотности.

Количество оксипролина пересчитывают на белки соедини­тельной ткани, умножая на коэффициент 8,07.

При содержании оксипролина до 25 мкг в 10 см³ окрашенного раствора в исследуемом образце можно работать без калибровоч­ного графика, пользуясь следующей формулой:

₌ D 0,01 100 100

0,164 Vm ' ⁽¹-^Ь)

где D— оптическая плотность; 0,01 — количество оксипролина, соответствующее 0,164 оптической плотности; 100 —объем раствора после нейтрализации; 100 — множитель для перевода в проценты; 0.164 — величина оптической плотности, полученная для чистого оксипролина; V— объем раствора, взятый для проведе­ния цветной реакции, см³; т — масса навески мяса, г.

Величина оптической плотности до 0,3—0,4 единицы пропор­циональна концентрации оксипролина.

79

Дли пересчета содержания соединительнотканных белков в мас ­совые доли от общею содержания белков используют уравнение

X,

8,0 7-У 6,25 Л'"

100,

(1.16)

где 8.07 — коэффициент пересчета оксипролина на белки соединительной ткани: л —массовая доля оксипролина. %; 6.25 — коэффициент пересчета на белки: .V— массовая доля общего азота в мясе, %.

Оформление результатов. Полученные экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы:

Образец или вил ткани

	Массовая доля, %
	азота	коллагена

По результатам экспериментальных исследований формулиру­ют выводы и делают общее заключение по работе. При этом реко­мендуется сравнить полученные данные с литературными, а также указать преимущества и недостатки используемых подходов в ана­лизе коллагена.

Лабораторная работа № 6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА КРОВИ

Цель работы. Освоить методы определения гемоглобина крови убойных животных на основе его биохимических свойств.

Задачи. Получить и изучить кристаллы гемоглобина из крови убойных животных. Провести качественные реакции на гемовую группу гемоглобина крови. Определить концентрацию растворен­ного гемоглобина в плазме крови.

Объекты исследования. Стабилизированная кровь и ее фракции от различных видов животных, полученные в условиях производ­ства; цельная кровь и плазма, выделенная в лабораторных услови­ях или при промышленной переработке крови.

Материалы, реактивы и оборудование. Физиологический раствор (раствор хлорида натрия массовой долей 0,85 %); ацетатный буфер рН 4,6 (4,9 см³ раствора CHXOONa • ЗН₂0 молярной концентрацией 0,2 моль/дм³ и 5,1 см³ раствора СН₃СООН молярной концентрацией 0,2 моль/дм³); раствор пероксида водорода массовой долей 0,3 %; спиртовой раствор бензидина массовой долей 0,1 %; этанол 96об.%; ледяная ук­сусная кислота; кристаллический хлорид натрия; стеклянные палочки; пробирки; пипетки; капельницы; штатив для проби­

80

рок: фот оэ.тект роколоримет р. часы, микроскоп: предметы*, стекла: покровные стекла.

Методические указания. Работа состоит из ipex этапов, каждый из которых может быть использован в экспериментальной прак­тике самостоятельно.

Гемоглобин разных животных различается белковой частью — глобином, который характеризуется различным сочетанием и со­отношением аминокислот, поэтому форма кристаллов гемоглоби­на неодинаковая.

Метод определения кристаллов гемоглобина основан на пред­варительном водном гемолизе эритроцитов с последующим осаждением кристаллического гемоглобина раствором этилово­го спирта.

Гемоглобин — сложный белок, который состоит из белка гло­бина и простетической группы — гема. Последний, в свою оче­редь, является сложным органическим соединением, содержащим четыре пиррольных кольца и двухвалентное железо.

Присутствие кристаллов гемина говорит о наличии гемоглоби­на в исследуемом объекте (рис. 1.24).

В основу количественного определения растворенного в плаз­ме крови гемоглобина положена его способность окислять в при­сутствии пероксида водорода бензидин в окрашенное соедине­ние (и-хинондиимид). Интенсивность окраски среды прямо про­порциональна содержанию гемоглобина и определяется фото- метрированием.

сн₃ сн=сн₂ сн₃ сн=сн₂

^ >=сн—\

N^ N'

СН

N.

"Fe—С1 СН

"Ч.

N

•S.

СН г^

СН₃ СН, I

СН,

СН, СН, I

СН,

СООН СООН а

Рис. 1.24. Хлоргемин:

а — структурная формула; б— кристаллы (х 500)

uu.MPitttHt КРИСТАЛЛОВ ГЕМОГЛОБИНА

Подютовка проб. Стабплизированную кровь жпвошых ( ПJ см'¹) центрифугируют в течение 5--S мни нрн частоте вращения 25—42 с Плазму (надосадочную жидкость) осторожно отби­рают пипеткой и переносят в чистую сухую пробирку (ее можно использовать для выполнения п.? данной работы). Осадок эритроцитов используют' для выделения кристаллов гемоглобина.

Порядок проведения анализа. В сухие чистые пробирки предварительно помещают но 1,5 см³ дистиллированной во­ды, а затем добавляют но 0,5 см³ эритроцитов и смесь тща­тельно перемешивают стеклянной палочкой. В результате про­исходит гемолиз эритроцитов — нарушение целостности обо­лочки. К гемолизованным эритроцитам добавляют 10 капель этанола 96 об.% и охлаждают (для этого используют смесь льда и хлорида натрия) в течение 40—60 мин. После этого каплю смеси наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют (используя объектив с увеличе­нием в 40 раз). Аналогичные операции проводят с кровью всех видов животных.

Оформление результатов. При нагревании гемоглобина в кис­лой среде небелковая группа — гем отщепляется и в присут­ствии солей (NaCl) переходит в г е м и н, в котором железо трехвалентно.

I !

= N N = =N N = \ ' \ '

Fe ^ Fe — С1

/ ч ^^ ✓ \

N' ^VN— N' ^VN —

Результаты наблюдений фиксируют в виде зарисовок с ука­занием объекта и применяемого увеличения (пример представ­лен на рис. 1.25).

После сопоставления рисунков сту­денты самостоятельно делают заклю­чение по работе, акцентируя внима­ние на форме, размерах и количестве кристаллов.

Рис. 1.25. Кристаллы гемоглобина морской свинки

(8x40)

82

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА ПО КАЧЕСТВЕННОЙ РЕАКЦИИ НА ГЕМОВУЮ ГРУППУ (ПРОБА ТЕЙХМАНА)

Подготовка проб. В качестве проб используют стабилизирован­ную кровь убойных животных без постороннего запаха, цвета и

коагулянтов.

Порядок проведения анализа. На предметное стекло наносят каплю крови и высушивают при температуре не выше 60 "С. К подсушенной крови прибавляют несколько кристаллов хлорида натрия и 1—2 капли ледяной уксусной кислоты, перемешивают, затем накрывают покровным стеклом и осторожно нагревают до начала кипения (но не кипятят).

После охлаждения гемин выделяется в виде коричневых ромбо­идальных кристаллов, которые рассматривают под микроскопом при кратности увеличения не менее х500. Операции проводят с кровью всех видов животных.

Результаты наблюдений фиксируют в виде зарисовок с указа­нием объекта и применяемого увеличения.

После сопоставления рисунков студенты самостоятельно де­лают заключение по работе, отмечая особенности строения кристаллов.

3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСТВОРЕННОГО ГЕМОГЛОБИНА

В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Подготовка проб. Для выполнения всех этапов работы исполь­зуют плазму после отделения форменных элементов из цельной крови в соответствии с рекомендациями (см. п. 1) либо свежую плазму, полученную путем сепарирования крови в производствен­ных условиях.

Порядок проведения анализа. В две пробирки вносят по 4 см³ ацетатного буфера, 2 см³ раствора пероксида водорода, 2 см³ раствора бензидина. В одну из пробирок (проба) добавляют 0,04 см³ плазмы крови, а в другую (контроль) — 0,04 см³ фи­зиологического раствора. Смеси в пробирках перемешивают и спустя 3 мин фотометрируют при 680 нм.

При наличии гемоглобина интенсивность синего окрашивания возрастает в течение 4—5 мин, поэтому оптическую плотность не­обходимо измерить два раза и записать максимальную величину. Через 5—6 мин после фотометрирования окрашивание приобре­тает лилово-бурый цвет, и величина оптической плотности при 680 нм уменьшается.

Массовую концентрацию гемоглобина в плазме крови находят с помощью калибровочного графика.

Построение калибровочного графика. Исходя из того, что в крови содержится в среднем 16,5 мг/см³ гемоглобина, для приготовления

83

основного сишдаргною раствора к 0,1см' крови добавляю] 16.4 см¹ дистиллированной волы. В 1см- этого раствора со­держится 1 mi гемо1.тобина. Его используют, разбавляя дистил­лированной водой, перед каждым построением калибровочного графика лля приготовления рабочих растворов крови с содер­жанием гемоглобина 0,5: 1,0: 2.5: 5.0: 10: 20: 30 мг/см³. По 0.04 см³ каждого рабочего раствора переносят в отдельные про­бирки, куда добавляют все необходимые реактивы для коли­чественного определения гемоглобина. Фотометрирование про­водят так же, как и в случае пробы с плазмой крови и фи­зиологическим раствором. По результатам измерений строят ка­либровочный график — зависимость оптической плотности ра­бочих растворов крови от массовой концентрации гемоглобина в этих растворах.

Для определения концентрации гемоглобина вычисляют раз­ность между оптической плотностью опытной (£>,) и контрольной (D₀) проб. По величине полученной разности находят соответству­ющее значение массовой концентрации гемоглобина на калибро­вочном графике.

Номер опыта, изме­рения

Наименование и характерис­тика образна плазмы крови (вид убойных животных, воз­раст, физиологическое состо­яние, способ первичной обра­ботки крови и т. д.)

Оптическая плотность

пробы (плазмы крови)

контроля (физиологи­ческого раст­вора)

Разность оптической плотности пробы и контроля

Массовая концентра­ция гемо­глобина, мг/см'

По окончании работы студенты самостоятельно делают выводы и формулируют заключение к работе. При этом дают сравнитель­ную характеристику экспериментальным данным, оценивают воз­можности и ограничения используемых подходов и методов.

Лабораторная работа № 7

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОРМ ГЕМОГЛОБИНА (ПИГМЕНТОВ) НА ОСНОВЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК

Цель работы. Приобрести практический навык определения пигментов крови убойных животных на основе спектроскопичес­ких методов анализа.

Задачи. Получить дериваты (формы) гемоглобина (оксигемо- глобин, метгемоглобин, карбоксигемоглобин); снять спектры по­глощения гемоглобина и его дериватов и идентифицировать фор­мы гемоглобина путем изучения характеристических полос погло­щения в соответствующих спектрах.

84

В С Г) V в

	Красный Желтый Зеленый Фиолеювыи
	1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1			1
II 1 1 II 1 1 II 1 1 II 1 1 II 1 1 1 1 1				1 1 1 1 1
1
II 1 1 II 1 1 II 1 1 II 1 1 II 1 1 II 1 1				1 1 1 1 1 1

II I II I

II I II I

Рис. 1.26. Спектры поглощения:

1— солнечный спектр; 2 — оксигемоглобин; 3 — гемоглобин; 4 — метгемоглобин (ней­тральный); В, С, D, £, F— характеристические линии спектра

Методические указания. Гемоглобин и его производные (фор­мы) обладают способностью поглощать излучение различной дли­ны волны и давать характерные спектры поглощения. Если между источником света и спектроскопом поместить сосуд с водным раствором гемоглобина или его производных, то эти вещества будут поглощать часть лучей определенной длины волны, в ре­зультате чего в этих местах появятся черные полосы (рис. 1.26), идентификация которых позволит судить о наличии соответству­ющих пигментов.

Спектроскопическое исследование пигментов крови можно проводить с помощью карманного спектроскопа.

Объекты исследования. Стабилизированная кровь убойных животных различных сроков хранения, получаемая в условиях производства.

Материалы, реактивы и оборудование. Свежеприготовленный раствор K₃[Fe(CN)₆] массовой долей 5 %; реактив Стокса; пробир­ки; пипетки; спектроскоп (спектрофотометр).

Приготовление реактивов. Реактив Стокса.1 часть суль­фата железа и 2 части виннокаменной кислоты растворяют в 15 частях дистиллированной воды; перед употреблением добавля­ют аммиак до слабощелочной реакции. Раствор должен быть про­зрачным и окрашен в зеленый цвет.

85

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОКСИГЕМОГЛОБИНА

Порядок проведения анализа. При идентификации оксигемо­глобина в пробирку к капле крови прибавляют 2 см³ дистиллиро­ванной воды и полученный раствор желтовато-розового цвета рас­сматривают в спектроскопе, помещая пробирку между источни­ком света и спектроскопом. О наличии оксигемоглобина судят по двум тонким полосам поглощения в желто-зеленой части спектра между так называемыми фраунгоферовыми линиями D и Е, т. е. в областях с длинами волн 578,1 и 541,7 нм.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА

Порядок проведения анализа. При идентификации гемоглобина к раствору крови (см. п. 1) прибавляют 5—8 капель свежеприго­товленного раствора K₃[Fe(CN₆)] (реактив Стокса). Двухвалент­ное железо, входящее в состав реактива Стокса, в этих условиях окисляется, переходит в трехвалентное, в результате чего образу­ется гемоглобин. Светло-синий цвет жидкости становится более темным, с фиолетовым оттенком, а в спектре появляется одна ши­рокая полоса между линиями Z) и Е. Наиболее темная ее часть со­ответствует длине волны 555—558 нм.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТГЕМОГЛОБИНА

Порядок проведения анализа. При идентификации метгемогло- бина (МНЬ) к раствору крови (см. п. 1) прибавляют 5—7 капель свежеприготовленного раствора K₃[Fe(CN)₆] массовой долей 5 % и взбалтывают. Жидкость приобретает бурую окраску. При этом обнаруживаются три полосы поглощения: две тонкие в желто-зе­леной части спектра между линиями D и Е и третья (наиболее ха­рактерная) в красной части спектра между линиями С и D с дли­ной волны 630 нм.

Оформление результатов. Данные по изучению спектров ге­моглобина и его производных рекомендуется оформить в виде таблицы:

Пигменты (цвет)	Форма гемоглобина	Характеристика спектров поглощения

По результатам экспериментальных исследований формулиру­ют выводы и делают заключение по работе.

86

Лабораторная работа № 8

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА И ОРГАНИЧЕСКОГО ЖЕЛЕЗА КРОВИ

Цель работы. Фотометрирование крови убойных животных и фракции форменных элементов.

Задачи. Определить и рассчитать массовые доли гемоглобина и органического железа в цельной крови и фракции форменных элементов крови убойных животных.

Объект исследования. Стабилизированная кровь различных ви­дов животных, полученная в условиях производства.

Материалы, реактивы и оборудование. Ацетонциангидрин (3 ампулы по 0,5 см³ или 0,47 г); смесь реактивов (3 флакона по 1,2 г), в том числе в каждом флаконе: калия гексацианофер- рата (II) тригидрат — 0,2 г, натрия гидрокарбонат — 1,0 г, стан­дартный раствор (СО) гемиглобинцианида; спектрофотометр; фотоэлектроколориметр; пипетки с делениями вместимостью 0,02 и 5 см³; колба мерная вместимостью 1000 см³; пробирки; штатив для пробирок.

Приготовление реактивов. Общее количество стандартного на­бора реактивов рассчитано на приготовление 3 дм³ трансфор­мирующего раствора (600 анализов). Используя 1/3 набора, мож­но готовить 1,0 дм³ трансформирующего раствора для проведе­ния 200 анализов.

Трансформирующий раствор (1 дм³). Содержи­мое одной ампулы с ацетонциангидрином и одного флакона со смесью калия гексацианоферрата (II) тригидрат с гидрокарбона­том натрия количественно переносят в мерную колбу и доводят дистиллированной водой до 1,0 дм³. Содержимое осторожно пе­ремешивают, избегая образования сильной пены. Раствор желто­го цвета, прозрачный.

Раствор стабилен при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. При появлении осадка или при обесцвечивании раствор непригоден к употреблению.

Стандартный раствор (СО) гемиглобинци­анида. Представляет собой стерильный прозрачный раствор оранжево-красноватого цвета. Окраска раствора зависит от содер­жания гемиглобинцианида. Концентрация гемиглобинцианида в растворе находится в диапазоне 0,6— 1,0 г/дм³, что соответствует при разведении крови в 251 раз концентрации гемиглобинциани­да в крови 150,6—251,0 г/дм³.

Методические указания. Метод основан на взаимодействии гемоглобина крови с железосинеродистым калием и окисле­нии его в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с анто- циангидрином окрашенный комплекс гемиглобинцианида. Ин-

87

lCHCMBHOCTb окраски ге.мш'лоониииаиила пропорциональна ко­личеству гемоглобина.

Относительная молекулярная масса гемоглобина точно уста­новлена, известна также масса железа в молекуле. В связи с этим количество органического железа можно легко рассчитать, зная массовую концентрацию гемоглобина в растворе.

Порядок проведения анализа. В пробирку с 5.0 см³ трансформи­рующего раствора добавляют 0,02 см³ свежей стабилизированной крови убойных животных (разбавление в 251 раз). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют на 10—20 мин. Затем проводят измерение оптической плотности раствора на лю­бом из вышеуказанных приборов при длине волны 540 нм (520— 560 нм) в кювете толщиной слоя 1 см против контрольной пробы (трансформирующего раствора).

Массовую концентрацию гемоглобина (НЬ) в крови (г%) опре­деляют по калибровочному графику, построенному по стандарт­ному раствору гемиглобинцианида.

Построение калибровочного графика. Ампулы с раствором СО гемиглобинцианида предварительно термостатируют при (20,0 ± ± 0,5) °С в течение 30 мин, после чего их встряхивают и готовят 5 стандартных растворов при помощи градуированной пипетки с делениями 1-го или 2-го класса точности вместимостью 5,0 см³ в соответствии с данными приведенной ниже таблицы.

Номер пробирки

Объем, с.м^;

СО гемигло­бинцианида

трансформиру­ющего раствора

Фактор разведения

Массовая концентрация гемоглобина в крови, г/дм"

11 4 0,2 0,2 х СО* х 251

3 2 3 0,4 0,4 х СО* х 251

3 3 2 0,6 0,6 х СО* х 251

4 4 1 0,8 0,8 х СО* х 251

5 5 - 1,0 СО* х 251

* СО — массовая концентрация гемиглобинцианида в растворе стандартного об­разца, г/дм³; 251 — коэффициент разведения.

Максимальная погрешность приготовления стандартных раст­воров по описанной методике составляет: 1,5% при использова­нии пипетки 2-го класса и 0,94 % при использовании пипетки 1 -го класса точности.

Измерение оптической плотности растворов проводят по мере возрастания их концентрации против контрольной пробы в усло­виях, аналогичных измерениям опытной пробы.

По полученным данным строят калибровочный график в ко­ординатах: по оси абсцисс — массовая концентрация гемоглоби­на, а по оси ординат — оптическая плотность раствора СО ге-

88

миглобинцианида. При смене партии реактшюн калибровочный график строит заново.

Массовую концентрацию гемоглобина (г%) можно также опре­делить по формуле

х = ^£^скот, (1.17)

где £■ _п. £_ст — экстинкшш соответственно опытной пробы и стандартного раство­ра; С—концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг%; А¹—ко­эффициент разведения крови; АГ=251; 0,001 — коэффициент пересчета количе­ства гемоглобина из мг% в г%.

Относительная молекулярная масса гемоглобина 64 ООО, в его структуре имеется один атом железа (атомная масса 56). После количественного определения гемоглобина рассчитывают кон­центрацию органического железа путем составления простой пропорции.

Полученные экспериментальные и расчетные данные сводят в таблицу:

Наименование образца,	Массовая доля, %
вид убойных животных	гемоглобина	органического железа

По результатам экспериментальных исследований формулиру­ют выводы и делают общее заключение по работе.

Лабораторная работа № 9 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПИГМЕНТОВ МЯСА

Цель работы. Приобрести практический навык при определе­нии общего количества и различных форм пигментов в мясе и мясопродуктах.

Задачи. Экстрагировать пигменты и измерить светопоглоще- ние растворов с последующим расчетом общего содержания пиг­ментов в образцах и соотношения пигментов по светопоглоще- нию проб.

Объекты исследования. Мышечная ткань разных видов живот­ных или мясо с различным содержанием мышечной ткани, а так­же субпродукты I категории.

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор ацетона объем­ной долей 94 % (к 470 см³ ацетона добавляют 30 см³ дистиллиро­ванной воды); раствор хлорацетона (СН₃СОСН₂С1) объемной до-

89

lei! NO ^rr (к X> с,-xt апегона лобавляют ')(!с\Г лис i палиронаиноп йоды п 10см¹ конпешрпрованной соляном кислоты): концентри­рованная соляная кислота: спектрофотометр: пипетки мерные вместимостью 1см': колбы плосколонные вместимостью 50см³: бумажные фильтры: чашки Петри.

Методические указания. Пигменты мяса и мясопродуктов хорошо растворимы в воде и органических растворителях и легко экстрагируются, придавая соответствующим растворам определенный цвет. Интенсивность окраски прямо пропор­циональна количеству пигментов. Измерив светопоглощение. легко определить концентрацию пигментов по калибровочному графику или используя рекомендуемые в конце работы рас­четные формулы.

Принцип получения спектров поглощения окрашенных ве­ществ, в частности пигментов мяса и крови, состоит в том, что световая энергия, проходя через раствор пигмента, поглощается этим раствором. Происходит абсорбция (поглощение света), кото­рую можно визуально обнаружить спектроскопически.

Формы миоглобина (Mb, МЬО, и MetlYlb) можно идентифици­ровать при определении спектральных характеристик образца с помощью спектрофотомегрических методов анализа.

Например, водный раствор Mb характеризуется специфичес­ким спектром поглощения в видимой области. Максимум погло­щения находится при длине волны 555 нм. Переход Mb в МЬ0₉, MetMb или какую-либо другую форму сопровождается изменени­ем спектра и в целом сдвигом максимума в сторону большей или меньшей длины волны (рис. 1.27).

Использование метода отражения позволяет анализировать формы миоглобина непосредственно в образце мяса без пред­варительной экстракции, что обеспечивает сохранение соотно­шения пигментных произ­водных.

Измерив поглощение мо­нохроматического пучка света и получив процент отраже­ния, рассчитывают коэффи­циенты поглощения (К) и рассеивания (6). Относитель­ные количества пигментов мяса определяют из отноше­ния K/S при соответствую­щих длинах волн:

X = 525 нм — максимум по­глощения для трех форм пиг­мента: дезокси-, окси- и мет- миоглобина;

90

Рис. 1.27. Спектры поглощения производ­ных миоглобина:

1 — оксимиоглобин; 2 — миоглобин; 3 — мет­миоглобин

X — 572 нм — максимум поглощения лля лезоксимпо] ло бина (Mb):

X 474 нм —- максимум поглощения лля оксп-(МЬСК) и мет- миоглобина (MetMb).

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ ПИГМЕНТОВ

Подготовка проб. При количественном определении общего со­держания пигментов из образцов разных видов мяса одного и того же срока хранения вырезают кусочки массой 5,000 ±0,001 г.

Порядок проведения анализа. Подготовленные образцы мяса помещают в стеклянные пробирки, заливают водным раствором ацетона объемной долей 94 % и гомогенизируют в течение 2 мин. В каждую пробирку к гомогенату добавляют 0,5 см³ концент­рированной соляной кислоты, пробирки встряхивают, закрывают пробкой и выдерживают в темном месте в течение 2 ч, периоди­чески перемешивая смесь. После этого растворы отфильтровыва­ют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 50 см³, а осадок промывают раствором хлорацетона объемной долей 80 %, доводя объем дистиллированной водой до метки.

Светопоглощение полученного раствора определяют на спект­рофотометре при длине волны 540 нм. В качестве контрольной пробы используют хлорацетон. Для определения массовой доли пигментов в исследуемом образце пользуются калибровочным графиком.

Построение калибровочного графика. Используют готовые очищенные препараты миоглобина либо свежие мышцы убой­ных животных. Подготовку образцов к количественному опре­делению общего содержания пигмента ведут аналогично описа­нию метода, нарезая для экстрагирования кусочки мышц фик­сированной массы от 1 до Юг. Количественное содержание миоглобина оценивают, исходя из известных данных о среднем содержании миоглобина (мг в 1 г) в мышцах крупного рогатого скота и свиней:

Мышцы крупного Мышцы свиней:

рогатого скота:

скелетные 3,7 скелетные:

сердца 2,1 красные 1,44

белые 0,79

сердца 0,92

Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс массовую концентрацию миоглобина (мг/см³ раствора), а по оси ординат — светопоглощение раствора при длине волны 540 нм.

91

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОРМ МИОГЛОБИНА (ПИГМЕНТОВ) НА ОСНОВЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК МЯСА

Подготовка проб. Каждый из исследуемых образцов мяса и мясо­продуктов нарезают ломтиками толщиной 4—5 мм перпендикуляр­но к направлению мышечных волокон, а затем вырезают кусочки в соответствии с размерами кювет используемого прибора.

Порядок проведения анализа. Вырезанные кусочки помещают в соответствующие по размеру кюветы измерительного прибора (спектрофотометра СФ-10, СФ-17 или другой марки). Снимают показания спектрофотометра по поглощению монохроматическо­го пучка света и проценту отражения. Соотношение пигментов и содержание относительных количеств пигментов мяса определяют расчетным путем.

Относительные количества метмиоглобина (^_е,_мь) и дезокси- миоглобина 0V_Mb) определяют по формулам:

^MetMb ^{= K}/^S512 ^K/^S525>

*МЬ= ^474 ^525' (^1Л9)

где К— коэффициент поглощения; S— коэффициент рассеивания при соответ­ствующих длинах волн.

Полученные экспериментальные и расчетные данные оформ­ляют в виде таблицы:

Образец	Исходный цвет	Массовая доля (%) пигментов мяса и мясопродуктов при длине волны
		суммарных (540 нм)	МЬО, (474 нм)	Mb (572 нм)	MctMb (650 нм)

По окончании работы и оформления результатов студенты само­стоятельно делают выводы и формулируют заключение, акцентиро­вав внимание на соотношении отдельных пигментов, сопоставляя данные с цветом образцов, сроками их хранения, видом мяса.

Лабораторная работа № 10 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИННОГО АЗОТА

Цель работы. Освоить титриметрические и фотометрические методы количественного определения суммарных аминокислот в тканях убойных животных.

Задача. Определить суммарное количество аминного азота.

92

Объекты исследования. 'Гканп животных (свежие пли после хранения в рекомендуемых режимах): образцы мышечной ткани убойных животных на разных стадиях автолиза; гидролизаты бел­ков крови, мышечной, соединительной ткани, кератинсодержа- шего сырья, комбинированных белковых систем.

Методические указания. Необходимость количественного опре­деления аминокислот возникает в ходе аминокислотного анализа белков, изучения свободных аминокислот, определения активнос­ти протеолитических ферментов и в других случаях. Предлагаемые способы определения могут быть использованы при анализе био­логических материалов животного или растительного происхож­дения, отдельных аминокислот или их смесей, а также белковых гидролизатов.

При определении количества аминного азота используют раз­личные способы.

Медный способ. Основан на способности аминокислот образо­вывать с ионами Си²⁺ прочные растворимые комплексы, в кото­рых каждый ион меди связан с двумя молекулами аминокислот:

Количество меди, вошедшей в состав таких комплексов, опре­деляют затем иодометрически. При выполнении анализа к опре­деленному объему раствора аминокислоты прибавляют при слабо­щелочной реакции избыток суспензии фосфата меди в боратном буфере, в результате чего после взбалтывания в раствор переходят медные соли большинства аминокислот. Избыток фосфата меди удаляют фильтрованием, к прозрачному фильтрату прибавляют уксусную кислоту и иодид калия. Образовавшийся при этом аце­тат меди восстанавливают иодидом калия.

Выделившийся иод титруют раствором гипосульфита натрия:

Таким образом, количество гипосульфита натрия, пошедшего на титрование, пропорционально исходному содержанию ами­нокислот в растворе. При этом 1 см³ раствора Na₇S₂0₃ молярной концентрацией 0,01 моль/дм³ соответствует 0,28 мг аминного азота.

2Cu(CH₃COO)₂ + 4KJ 2CuJ + 4СН₃СООК + J

J₂ + 2Na₂S₂0₃ 2NaJ + Na₂S₄0₆.

2°2^W3

2 4 6

93

Небольшое количество аммиака и высокие концентрации мочеви­ны не мешают определению аминного азота медным способом.

Нингидриновый способ. Нингидрин, являющийся сильным окислителем, вызывает окислительное дезаминирование амино­кислоты, приводящее к образованию диоксида углерода, соответ­ствующего альдегида, воды и конденсированного соединения («пурпура Руэмана») сине-фиолетового цвета с максимумом по­глощения около 580 нм.

HoN—СН—СООН + 2

R

Аминокислота

О Л со,

Нингидрин СН

О

ОН о

«Пурпур Руэмана»

Поскольку оптическая плотность при этой длине волны прак­тически линейно зависит от числа исходных аминогрупп, на осно­ве нингидриновой реакции разработан удобный колориметричес­кий способ количественного определения аминного азота. При нагревании с органическими растворителями альдегиды не обра­зуются, а радикалы аминокислот входят в состав производных «пурпура Руэмана», присоединяясь к атому азота. Таким образом, в этом случае цвет образующихся окрашенных продуктов зависит от природы аминокислоты. Пролин и оксипролин (иминокисло- ты) в процессе реакции с нингидрином образуют продукты ярко- оранжевого цвета с максимумом поглощения около 440 нм.

Способ формольного титрования. Основан на способности ами­нокислот реагировать с нейтральным раствором формальдегида с образованием метиленаминокислот. Этот метод применяется для определения карбоксильных групп аминокислот, которые титру­ют раствором щелочи, предварительно блокировав аминогруппы формальдегидом. В ходе реакции с формальдегидом аминогруппа теряет основные свойства, при этом образуется метиленаминокис- лота, которая оттитровывается щелочью:

R

Н

R

H-C-NHT + СО H-C-N=CHT + Н->0 ;

СООН

СООН Н R

Н—С—N=CH₇ + NaOH —H-C-N=CH, + Н,0

R

СООН

COONa

94

Определяя количество карбоксильных гр\пп титрованием, можно одновременно определиib и количество о-амино1 рупп. так как количество карбоксильных трупп жипва.тетпно коли­честву а-аминогрупп. связанных формальдегидом. При органи­зации лабораторного практикума можно использовать один или несколько методов.

Подготовка проб. При использовании в качестве объектов ис­следования животных тканей готовят водяную вытяжку белковых фракций. Ткань освобождают от жира и прорезей соединительной ткани. Навеску массой 3—4 г тщательно измельчают ножом на ча­совом стекле. К навеске измельченного сырья приливают дистил­лированную воду в соотношении 1 : 6 (по массе) и ведут экстрак­цию на холоде при О °С в течение 30 мин. Затем центрифугирова­нием при частоте вращения 83 с"¹ в течение 5 мин отделяют оса­док. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и исполь­зуют для количественного определения аминокислот.

При использовании в качестве объектов исследования белко­вых гидролизатов их фильтруют, фильтраты используют для коли­чественного определения аминокислот.

1. МЕДНЫЙ СПОСОБ

Материалы, реактивы и оборудование. Суспензия фосфата меди: раствор тимолфталеина: 0,25 г в 100 см³ раствора этанола массовой долей 50%; раствор NaOH молярной концентрацией 1 моль/дм³; ледяная уксусная кислота; раствор KJ массовой долей 15 %; раст­вор Na₂S₂0₃ молярной концентрацией 0,01 моль/дм³; раствор крах­мала массовой долей 1 %.

Приготовление реактивов. Суспензия фосфата меди. Непосредственно перед использованием к одному объему раство­ра А добавляют два объема раствора Б, тщательно перемешивают и прибавляют два объема раствора В. Хранят не более 2—3 дней.

Раствор А: 27,3 г хлорида меди (I) растворяют в 1 дм³ воды.

Раствор Б: 64,5 г двузамещенного фосфата натрия растворяют в 500 см³ воды, добавляют 7,2 г NaOH и затем доводят объем во­дой до 1 дм³.

Раствор В (боратный буфер рН 8,6—8,8): 57,21 г буры (Na₂B₄0₇ • 10Н₂0) растворяют в 1,5 дм³ воды, добавляют 100 см³ раствора НС1 молярной концентрацией 1 моль/дм³ и доводят объем водой до 2 дм³.

Порядок проведения анализа. В мерную колбу вместимостью 25 см³ помещают либо 2 см³ нейтральной вытяжки, либо 2 см³ гидролизата белка, либо 2 см³ раствора аминокислоты, 1—2 кап­ли раствора тимолфталеина и по каплям добавляют раствор NaOH до светло-голубого окрашивания (рН около 9). Затем в колбу при­ливают 10 см³ хорошо перемешанной суспензии фосфата меди и

95

объем доводят водой до метки. Содержимое мерной колбы тща­тельно перемешивают и оставляют на 5—10 мин при комнатной температуре, а затем фильтруют через плотный фильтр в сухую коническую колбу вместимостью 50 см³. Если фильтрат окажется мутным, повторно проводят фильтрование, иначе результаты оп­ределения будут завышены. 10 см³ прозрачного фильтрата отби­рают в сухую колбу, добавляют 0,4 см³ ледяной уксусной кислоты и 4 см³ раствора KJ массовой долей 15%. Выделившийся иод титруют раствором гипосульфита натрия до светло-желтой ок­раски, прибавляют 1—2 капли раствора крахмала и осторожно титруют до исчезновения сине-фиолетовой окраски. Определе­ния проводят в двух повторностях и вычисляют среднее значение объема гипосульфита натрия (V_on), пошедшего на титрование. Параллельно при тех же условиях обрабатывают контрольную пробу, содержащую вместо раствора аминокислоты 2 см³ воды. Контроль проводят для определения возможного наличия раст­воримых соединений меди в используемой суспензии. Объем раствора гипосульфита натрия, пошедшего на титрование конт­роля, обозначают V_K.

Содержание аминного азота (мг) в 2 см³ исследуемого раствора определяют по формуле

С= 0,28( V_on — V_K)K- 2,5, (1.20)

где К— коэффициент пересчета на раствор гипосульфита натрия молярной кон­центрацией 0,01 моль/дм³.

Если исследуемый раствор содержит только одну аминокисло­ту (например, глицин), то для определения ее массовой доли ве­личину С умножают на коэффициент М/14, где М— молекуляр­ная масса данной аминокислоты (для глицина М= 75).

2. НИНГИДРИНОВЫЙ СПОСОБ

Материалы, реактивы и оборудование. Фосфатный буфер (рН 6,5; 0,5 моль/дм³); абсолютный ацетон; смесь абсолютных ацетона и этанола (1:1 по объему); раствор нингидрина мас­совой долей 0,5 % в «-бутаноле; насыщенный раствор барие­вой воды.

Порядок проведения анализа. В пробирку с пришлифованной пробкой помещают 0,1см³ исследуемой пробы, 0,1см³ буфера, 1,5 см³ смеси ацетона со спиртом и 2 см³ нингидрина. Содержи­мое пробирки перемешивают и закрывают пробкой. Пробирки помещают на 15 мин на водяную баню при температуре кипения. Затем пробирку охлаждают под струей воды, объем окрашенной

96

жидкости доводят ацетоном до И>см". перемешиваю! и кодори- мсгрируют при длине isoain.i 5 SO нм протпь кошроля. солержашс- го вместо пробы 0.1 ем-¹ волы.

Содержание аминного а .о;л или аминокислот расечшываю¹, по калибровочному \ рафику.

Построение калибровочного графика. Используют стандартны!! раствор глпшша с содержанием 1 мг/см-\ Из него готовят ряд разведений: 1 см³ раствора вносят в мерную пробирку вместимо­стью 10 см³ и доводят объем дистиллированной водой до метки, затем проводят окрашивание в соответствии с описанием метода и строят график зависимости оптической плотности от концен­трации глицина. Чувствительность метода от 5 до 25 мкг амин­ного азота в пробе (0.1 см¹), что соответствует приблизительно 20—120 мкг глицина.

3. СПОСОБ ФОРМОЛЬНОГО ТИТРОВАНИЯ

Материалы, реактивы и оборудование. Складчатый бумажный фильтр; сухой хлорид бария; спиртовой раствор фенолфталеина массовой долей 0.1 %; раствор соляной кислоты (0.01 моль/дм³); раствор гидроксида калия (0,05 моль/дм³); формольная смесь; колбы мерные вместимостью 100 см³; капельницы; воронка стек­лянная; бюретка; часы; насыщенный раствор бариевой воды.

Приготовление реактивов. Формольная смесь. К 50 см³ раствора формальдегида объемной долей 40% добавляют 10 ка­пель раствора фенолфталеина массовой долей 0,1 % и по каплям раствор гидроксида калия молярной концентрацией 0,1 моль/дм³ до образования слабо-розовой окраски.

Порядок проведения анализа. К 25 см³ исследуемой пробы в колбе прибавляют 1 г хлорида бария, 10 капель раствора фенол­фталеина и перемешивают. К смеси приливают насыщенный раствор бариевой воды до появления едва заметного розового окрашивания. Колбу закрывают и оставляют на 15 мин. Затем разбавляют водой до объема 100 см³ и фосфаты и карбонаты бария отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр. Готовят две колбы вместимостью по 100 см³. В одну вносят 40 см³ фильт­рата, что соответствует 10 см³ раствора аминокислот, во вторую — 40 см³ дистиллированной воды. Прибавляют по 10 капель раство­ра фенолфталеина и раствор соляной кислоты (осторожно) до ок­рашивания растворов (контроля и пробы) в едва заметный розо­вый цвет. Затем в обе колбы вносят по 10 см³ формольной смеси и титруют из бюретки раствором гидроксида калия до появления едва заметной розовой окраски. Цвет контроля и пробы должен быть одинаковым.

97

Содержание лмишюи» ,t нни (мг/е.и- ) раеечт ыв<ноi по формхле

С- < Г. -- 1₍₁)К0? I. и.21)

где Г, и Г, --обьемы рлсгворл гидрокепдд калия, затраченные соотьектвснно на ппрование нрооы и контроля, ем': А'- коэффициент пересчета на раствор тдро- ксида калия молярной концентрацией 0.05 моль/дмЛ О— масса аминокислот, эк­вивалентная 1 см' (0.05 моль/дм') раствора гидроксида калим (0.7 мг); V — объем исследуемой пробы, взятой для анализа, ем⁵.

Оформление результатов. Полученные экспериментальные и расчетные данные рекомендуется оформить в виде таблицы:

Содержание аминного азот, мг/см⁵

Объе к г I !с сл е до ва н и я

Ci (особ о! (ределеиия, принцип метода

Затем следует самостоятельно их проанализировать и сформу­лировать выводы по данной работе. Следует отметить трудоем­кость и точность методов, сравнить экспериментальные данные, полученные различными способами, между собой и с данными литературы.

Лабораторная работа №11

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИПТОФАНА

Цель работы. Приобрести навык количественного определения триптофана в тканях и мясе животных и птицы.

Задачи. Освоить методы подготовки проб, провести качествен­ную реакцию на триптофан и рассчитать его количество.

Объекты исследования. Образцы мышечной ткани или мяса жи­вотных и птицы, колбасные изделия, полуфабрикаты.

Материалы, реактивы и оборудование. Ацетон (х. ч.); раст­вор гидроксида натрия молярной концентрацией 3 моль/дм³; раствор яя/?д-диметиламинобензальдегида массовой долей 2,5 % в растворе серной кислоты массовой долей Ю %; раствор нитра­та натрия массовой долей 2 %; соляная кислота концентри­рованная; раствор этанола (50 об.%); универсальный индика­тор; спиртовой раствор фенолрота массовой долей 0,1 %; крис­таллический триптофан (х. ч.); дистиллированная вода; раствор H₂S0₄ массовой концентрацией 3 моль/дм³; центрифуга лабо­раторная; водяная баня; спектрофотометр или фотоэлектроко- лориметр; стеклянные пипетки; колбы; стаканы; ампулы; стек­лянные палочки.

98

Методические указания. '1риитофан и юс гаг очно оо. 1ьшом ко­личестве содержится в белках животного происхождения. Трип­тофан имеет гетероциклическую структуру, содержит имино- группу ( —NH —):

сн—сн-соон

NH-

н

В основу метода определения триптофана положена цветная реакция между продуктами его распада, образующимися при об­работке триптофана концентрированной соляной кислотой и пара- диметиламинобензальдегидом в присутствии нитрата натрия.

Для выделения триптофана обезжиренную мышечную ткань подвергают щелочному гидролизу. В процессе кислотного гидро­лиза и в присутствии жира при щелочном гидролизе триптофан разрушается. Метод определения триптофана в мясе состоит из следующих основных операций: обезжиривания навески мяса, гид­ролиза обезжиренной мышечной ткани гидроксидом натрия, ней­трализации гидролизата и фильтрования, окисления триптофана и развития цветной реакции с яа/?я-диметиламинобензальдегидом, фиксации окраски этанолом и измерения ее интенсивности.

При количественном определении триптофана в образцах ис­пользуют калибровочный график.

Подготовка проб. Образец измельченного мяса или ткани мас­сой (4,000 ± 0,0002) г помещают в центрифужный стакан вмести­мостью не менее 100 см³, добавляют 4 см³ дистиллированной воды и тщательно растирают. Для обезжиривания заливают ацетоном, доводя до объема 40 см³, и перемешивают. Смесь выдерживают 30 мин при температуре (20 ± 5) °С и центрифугируют в течение 20 мин при частоте вращения 41,7 с^-1. Жидкость сливают с осадка и нагревают при 80 °С на водяной бане, перемешивая осадок стек­лянной палочкой.

Остаток количественно переносят в стеклянную пробирку с пришлифованной пробкой или ампулу, смывая остатки дистилли­рованной водой (4 см³). Затем приливают 20 см³ (3 моль/дм³) раст­вора гидроксида натрия. Пробирку закрывают пробкой, а ампулу запаивают, подписывают каждый образец и гидролизуют в тече­ние суток при температуре 112— 114 °С.

Для ускорения процесса гидролиза можно использовать авто- клавирование при 0,1 МПа в течение 2—3 ч.

Порядок проведения анализа. Полученные гидролизаты охлаж­дают и количественно переносят в колбу вместимостью 100 см³, доливая дистиллированную воду до 2/3 объема. Раствор нейтрали­

99

зуют сначала небольшим объемом (3 моль/дм-') раствора H-,S0₄. а аатем более разбавленными ее растворами. Нейтрализацию ведут в присутствии индикаторов (универсальной индикаторной бумаги или фенолфталеина).

Колбу охлаждают, объем доводят до метки, а смесь фильтру­ют через бумажный фильтр (гидролизат должен быть совершенно прозрачным!).

Для проведения цветной реакции в мерную посуду вмести­мостью 100 см³ с пришлифованной пробкой приливают пипетка­ми растворы в последовательности: 1 см³ исследуемого фильтрата, 0,5 см³ раствора /ш/хз-диметиламинобензальдегида (при встряхи­вании!), 0,2 см³ раствора NaN0₃ массовой долей 2 % (при встряхи­вании!) и 28 см³ концентрированной соляной кислоты (под тя­гой). Растворы оставляют при температуре (20 ± 5) °С на 30 мин для развития окраски, а затем доводят до метки раствором этанола массовой долей 50 %.

Одновременно проводят два основных и два контрольных определения. В последних исследуемый фильтрат заменяют 1 см³ дистиллированной воды.

Интенсивность синей окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 610 нм или на фотоэлектроколориметре с крас­ным светофильтром в отношении контрольного раствора.

Концентрацию триптофана в объеме жидкости, взятой для цвет­ной реакции (1 см³), определяют по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Для построения графика готовят растворы, содержащие известное количество триптофа­на. Три навески химически чистого триптофана массой по 50 мг растворяют в 20 см³ раствора гидроксида натрия молярной кон­центрацией 3 моль/дм³. Растворы триптофана гидролизуют в ус­ловиях, аналогичных опыту, и фильтруют, доводя предваритель­но объем до 50 см³. 1 см³ полученного раствора содержит 1 мг триптофана. Затем готовят ряд стандартных растворов в соответ­ствии с приведенными ниже рекомендациями, проводят цветную реакцию, измеряют оптическую плотность и строят график зави­симости оптической плотности раствора от массового содержа­ния триптофана.

Рекомендуемые объемы стандартного раствора триптофана для построения калибровочного графика:

Содержание	Объем, см5		Содержание	Объем, см3
триптофана, мкг	стандартного раствора	воды	триптофана, мкг	стандартного раствора	воды
100	0,1	0,9	400	0,4	0,6
200	0,2	0,8	500	0,5	0,5
300	0,3	0,7	600	0,6	0,4

100

По средним данным трех се­рий опытов строят калибровоч­ный график (рис. 1.28).

Массовую долю триптофана (мг%) в исследуемом образце рассчитывают по формуле

X

с -50 100 Vm

(1.22)

где с — концентрация триптофана, най­денная по калибровочному графику. мкг/см³; 50 — объем раствора, получен­ный после нейтрализации и разведе­ния, см³: 100 — коэффициент пересчета в проценты; V— объем раствора, взя­тый для цветной реакции, см³; т — мас­са навески мяса. г.

300 с, мкг /см

Рис. 1.28. Калибровочный график для определения триптофана:

I — без гидролиза; 2 — после щелочного гидролиза

Оформление результатов. Полученные экспериментальные и расчетные данные рекомендуется оформить в виде таблицы:

Объект исследования	Концентрация триптофана по калибровочному графику, мкг/см'	Содержание триптофана в образце, мг%

При формулировании выводов по работе следует сравнить по­лученные данные с литературными, а также сделать сравнитель­ный анализ результатов для различных видов мяса.

Лабораторная работа № 12 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЛИНА

Цель работы. Приобрести практический навык в определении пролина (оксипролина) в образцах мышечной ткани или мяса раз­ных видов убойных животных, а также в мясопродуктах, готовых к употреблению.

Задачи. Получить гидролизат белков в анализируемых пробах; провести качественную реакцию на оксипролин и фотометриро- вание с последующим расчетом его массовой доли.

Объекты исследования. Мышечная или соединительная ткань, мясо различных сортов, а также мясопродукты.

Материалы, реактивы и оборудование. Бумага индикаторная универсальная; кипятильные камни; бумага фильтровальная ла­бораторная или фильтры бумажные; фольга алюминиевая; хло­рамин Т; хлорамин Б; раствор соляной кислоты молярной кон-

101

цептрацией 6 моль/лмраствор гидроксида иачрия молярной концентрацией 10моль/дм-\ пронанол: кислота лимонная: кисло­та уксусная, ацетат натрия: /ш/;л-лнметиламинобензальдегид: кис­лота хлорная объемной долей не менее 40 пода дистиллирован- ная: стандартный препарат оксипролина: мясорубка или электро­мясорубка бытовая с отверстиями решетки диаметром от 3 до 4 мм; весы лабораторные: баня водяная и песчаная: колба стек­лянная гидролизная вместимостью до 300 см³: холодильники стек­лянные водяные или воздушные; электронагревательное устрой­ство с песчаной баней; колбы мерные вместимостью 100 и 250 см³: воронки стеклянные; пробирки стеклянные; пипетки мерные вместимостью 2, 5 и 10 см³; спектрофотометр или фотоэлектроко- лориметр с интерференционным фильтром (рабочая длина кювет 30—50 мм, зеленый светофильтр).

Приготовление реактивов. Реактив для окисления: 1,41 г хлорамина Т или Б растворяют в 10 см³ воды и последова­тельно добавляют 10 см³ пропанола и 80 см³ буферного раствора. Раствор должен быть свежеприготовленным.

Цветной реактив: Юг яара-диметиламинобензальде- гида растворяют в 35 см³ хлорной кислоты, непрерывно пере­мешивая. Полученный раствор смешивают с 65 см³ пропанола. Раствор следует готовить в день использования.

Буферный раствор (рН 6,0): 50 г лимонной кисло­ты; 12 см³ уксусной кислоты массовой долей 96 %; 120 г ацета­та натрия; 34 г гидроксида натрия растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 см³ и доводят до метки дистиллированной водой. Полученный раствор смешивают с 200 см³ воды и 300 см³ пропанола.

Методические указания. Определение оксипролина предусмот­рено нормативной документацией на ряд мясных продуктов, так как этот показатель позволяет судить о пищевой ценности мяса и изделий из него.

Метод основан на выделении оксипролина при кислотном гид­ролизе пробы продукта, проведении цветной реакции с продукта­ми ее окисления и спектрофотометрическом измерении интен­сивности развивающейся окраски. После определения рассчиты­вают массовую долю пролина. В качестве объектов исследования рекомендуется использовать ткани и мясо различных анатомичес­ких участков туш животных, колбасы разных сортов и различные полуфабрикаты.

Подготовка проб. Образец мышечной или другой ткани мя­са, мясопродуктов массой не менее 50 г пропускают через мясо­рубку не менее двух раз до тонкого измельчения и тщательно перемешивают.

В коническую колбу вместимостью 300 см³ помешают около 4 г продукта, взвешенного с точностью не менее ± 0,0002 г. Добавля­ют 100 см³ (6 моль/дм³) раствора соляной кислоты и кипятильные

102

камни лля равномерного кипения. Колбу соединяют е воздушным или водяным холодильником и нагревают на песчаной бане в те­чение 7 ч при гидролизе проб вареных и полукопченых мясных продуктов, в течение 8 ч —- при гидролизе проб мяса и сырокопче­ных мясных продуктов.

Теплый гидролизат фильтруют в мерную колбу вместимостью 250 см³. смывая гидролизную колбу и фильтр дистиллированной водой. Объем колбы доводят водой до метки и смесь тщательно перемешивают.

Порядок проведения анализа. Гидролизаты мясных продуктов разбавляют, доводя концентрацию оксипролина до 1—4мкг/см³. Для этого 4—10 см³ гидролизата (в зависимости от предполагаемого содержания оксипролина в испытуемом продукте) вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и нейтрализуют раствором гидроксида натрия молярной концентрацией 10 моль/дм-⁵ по индикаторной бу­маге до рН 6,0. Объем доводят водой до метки и перемешивают. Переносят 4 см³ этого раствора в пробирку и добавляют 2 см³ реак­тива для окисления, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Затем добавляют 2 см³ цветного реактива, перемешивают и пробирку закрывают алюминиевой фольгой. Од­новременно готовят два контрольных раствора, используя вместо фильтрата дистиллированную воду. Пробирки быстро переносят на водяную баню температурой (60 ± 0,5) °С и нагревают в течение 15 мин, затем их охлаждают в течение 3 мин водой или льдом и не позднее чем через 30 мин измеряют оптическую плотность опытно­го раствора на спектрофотометре при длине волны 558 нм относи­тельно контрольного. Предварительно измеряют оптическую плот­ность контрольных растворов одного относительно другого.

Построение калибровочного графика. Для построения графи­ка готовят основной раствор оксипролина. 100 мг стандартно­го препарата оксипролина растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 см³, добавляют каплю раствора соляной кис­лоты молярной концентрацией 6 моль/дм³ и доводят водой до метки. В день использования берут 1 см³ основного раствора в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят водой до мет­ки, тщательно перемешивая. 1 см³ этого раствора содержит 0,01 мг оксипролина.

Затем готовят четыре стандартных раствора путем разбавления 5, 10, 20 и 30 см³ основного раствора оксипролина водой в мер­ных колбах вместимостью 100 см³ для получения соответственно растворов следующих концентраций: 0,5; 1; 2 и 3 мкг/см³.

Далее измеряют оптическую плотность стандартных растворов оксипролина при длине волны 558 нм. Всю операцию повторяют, используя для определения по 4 см³ четырех разбавленных стан­дартных растворов оксипролина.

По полученным средним данным строят калибровочный гра­фик, откладывая на оси ординат величины оптической плотности,

103

а па оси абсцисс копией iраппю оксипролина. По отмеченным •очкам проводят прямую линию.

Массовую лолю окспнролпна (л ) вычисляю! по форм\ле

с ■ 250 100 ■ 100

глс с -- концентрации оксипролина. найденная по калибровочному графи­ку. mki/смЛ 250 —обший объем гидролизата. см Л 100 —объем гидролизата после нейтрализации. см Л 100 — коэффициент пересчета в проценты: т — масса навес­ки образца, взятая для анализа, г; В—объем гидролизата. взятый для нейтрализа­ции. емД 10^fl — коэффициент пересчета мкг в г.

Полученные экспериментальные и расчетные данные оформ­ляют в виде таблицы:

Массовая лоля оксипролина в образце, ^гг

По результатам проведенных исследований делают выводы и общее заключение по работе. При этом расчетные данные реко­мендуется сравнить с данными литературы, провести оценку и сравнение содержания оксипролина в различных сырых образцах и продуктах.

Лабораторная работа № 13

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ

Цель работы. Приобрести практический навык при анализе белков мяса методом гель-фильтрации.

Задачи. Подготовка проб к анализу; калибрование хроматогра- фической колонки и разделение веществ с выделением белковых фракций.

Объекты исследования. Мясо и мясопродукты.

Материалы, реактивы и оборудование. Стеклянные пипетки; фильтровальная бумага; лед; натрий-фосфатный или калий-фос­фатный буфер (растворы молярной концентрацией 0,05 моль/дм³, содержащие раствор КС1 молярной концентрацией 0,05, рН 6,5); сефадекс G-100; белки известной молекулярной массы: яич­ный альбумин 45 000 Да или бычий сывороточный альбумин 68 000 Да; раствор НСЮ₄; раствор КОН молярной концентра­цией 5 моль/дм³; этанол 80 и 96об.%; водяная баня; хромато- графическая колонка; коллектор фракций; колбы вместимос-

Объе кт 11 сслел она ним

Оптическая плот­ность раствора

Кон не нт рация о кс и п рол и н а по катибровочному iрафику. мкг/см^:

104

тыо 20U—500 см-: i omoi енпзатор: стеклянные пробирки: чашки Петри: центрифуга лабораторная: фарфоровые чашки: стеклян­ные палочки.

Методические указания. В анализе белков наибольшее приме­нение нашел метод гель-фильтрации. Для успешного использова­ния метода необходимо правильно подготовить колонку с иссле­дуемым для разделения материалом.

Сухой сефадекс суспендируют в 200-кратном объеме воды и ос­тавляют на 48 ч при комнатной температуре для полного набуха­ния. Процесс набухания можно ускорить, проводя его на водяной бане при температуре кипения в течение 5 ч.

В колонку (размером 1,5 х 50 см) вносят относительно густую суспензию полностью набухшего геля. Для предотвращения об­разования пузырьков воздуха в слое геля в колонке суспензию сефадекса перед заполнением колонки можно деаэрировать с по­мощью водоструйного насоса в колбе Бунзена или вносить его в колонку при температуре, значительно превышающей комнат­ную (50—60 °С). Сефадексу в колонке дают отстояться, затем с целью уравновешивания и достижения постоянной высоты стол­ба геля колонку промывают 3—5 объемами буферного раствора. Гидростатическое давление для сефадекса G-100 не должно пре­вышать 50 см при высоте столба жидкости в колонке 20—50 см (давление при разделении образца и при заполнении колонки должно быть одинаковым). Для проверки равномерности запол­нения через колонку можно пропустить раствор окрашенного белка, например цитохрома с, или голубого декстрана. При этом окрашенная зона должна быть компактной и двигаться по ко­лонке параллельно ее основанию.

Сначала определяют свободный объем колонки (V₀). Для этого через колонку пропускают 1 см³ (1 мг/см³) раствора голу­бого декстрана в растворе сахарозы (0,5 моль/дм³). В качестве растворителя как для голубого декстрана, так и для исследуе­мых белков применяют тот же буферный раствор, которым уравновешена колонка. Им же элюируют белки с колонки пос­ле нанесения анализируемой смеси. Следует заметить, что по­скольку положительно заряженные частицы могут частично взаимодействовать с сефадексом (за счет имеющихся карбо­ксильных групп), то для элюирования обычно используют раст­воры с ионной силой выше 0,02.

Вытекающий из колонки буферный раствор собирают в про­бирки порциями по 1—3 см³. Регистрацию объема элюата, про­шедшего через колонку, начинают с момента нанесения образца на колонку. Многократное использование колонки с сефадексом приводит к замедленному протеканию жидкости через нее. В этом случае гель извлекают из колонки, отмучивают его от мелких час­тиц, а колонку заполняют заново.

Сефадексы можно хранить в виде суспензии или порошка.

105

Суспензию сефадекса слелует хранить и холодильнике вместе с антисептиками: азилом натрия массовой долей 0.02 мертиола- гом пли хлороформом. Для перевода геля в сухое состояние еефа- декс сначала промывают водой лля удаления солей, а затем выдер­живают несколько минут в 2-кратном объеме этанола (50 об. %): после фильтрования через воронку Бюхнера сефадекс выдержива­ют в 2-кратном объеме этанола (96 об.%). обработку последним повторяют несколько раз. Затем осадок высушивают в термостате при 60-80 °С.

Подготовка проб. Пробы можно готовить следующими спо­собами:

1. Навеску мышечной ткани массой 3—5 г или какого-либо другого образца тщательно освобождают от жира, соединитель­ной ткани и измельчают ножницами на холоде. К кашице до­бавляют 5 объемов раствора НС10₄ молярной концентрацией 0,5 моль/дм³, ткань гомогенизируют или тщательно растирают в ступке (примерно 30 мин). Суспензию центрифугируют, центри- фугат сливают, а остаток вновь суспендируют в 1 — 1,5 объема раствора НСЮ₄. Промывные воды соединяют с основным центри- фугатом и для удаления НСЮ₄ добавляют раствор КОН молярной концентрацией 5 моль/дм³. Необходимый объем щелочи рассчи­тывают и после нейтрализации проверяют рН по универсальному индикатору. Для более полного осаждения перхлората калия цент- рифугат охлаждают (можно оставить на ночь в холодильнике). Осадок КС10₄ удаляют центрифугированием или фильтрованием и промывают очень небольшим объемом хорошо охлажденной воды, фильтрат упаривают досуха на роторном испарителе (темпе­ратура 40 °С) или водяной бане (температура бани не более 50— 60 °С). Сухой остаток используют в качестве пробы.

2. Экстракт получают при дополнительной обработке ткани спиртом. Это дает возможность получить экстракт, не содержа­щий солей, которые ухудшают качество хроматограмм. Способ сводится к следующему. Около 5 г сырья или продукта помещают в чашку Петри, стоящую во льду, очищают от жира, соединитель­ной ткани и кровеносных сосудов. Навеску ткани массой 2—3 г измельчают ножницами на холоде до состояния грубой кашицы. Последнюю переносят с 5 объемами этанола (96 об.%) в гомогени­затор, стоящий во льду. Содержимое гомогенизатора перемешива­ют стеклянной палочкой и гомогенизируют в течение 10 мин. Го- могенат сливают в центрифужный стакан. Гомогенизатор ополас­кивают 5 см³ этанола (96об.%) и промывные воды присоединяют к основному гомогенату. Последний оставляют при комнатной температуре на 20 мин, затем центрифугируют в течение 8—10 мин при частоте вращения 50 с^-1. Надосадочную жидкость сливают в мерную колбу вместимостью 200 см³, а осадок трижды промывают 15 см³ этанола (80об.%), каждый раз сливая промывные воды в мерную колбу. К спиртовому экстракту, находящемуся в колбе,

106

прилипают ! 60--1 SO см-^Л хлороформа гак. чнюы мениск жидкое! и был на 1.5—2 см ниже края горлышка колбы. Колбу закрываю! пробкой (лучше стеклянной), встряхиваю! в течение 10—15 мин. помешают в холодильник и оставляют там до тех пор. пока четко не обозначится граница между водным и сниртохлороформным слоями. Водный (верхний) слой жидкости, содержащий амино­кислоты, отбирают пипеткой с загнутым конном, используя ре­зиновую грушу, и переносят в фарфоровую чашку. В колбу добав­ляют дистиллированную воду (2—3 см³), а в случае необходимости хлороформ, чтобы уровень жидкости в колбе был на 1,5—2 см ниже края горлышка колбы. Содержимое колбы встряхивают и оставляют для расслаивания. Верхний слой жидкости отсасывают и присоединяют к жидкости, находящейся в фарфоровой чашке. Эту операцию повторяют еще 2 раза. Содержимое фарфоровой чашки упаривают на роторном испарителе при температуре около 40 °С или водяной бане (температура бани 50—60 °С). В дальней шем оба способа обработки ткани совпадают.

Порядок проведения анализа. Перед использованием подготов­ленной к работе колонки с сефадексом проводят ее калиброва­ние, т. е. пропускают через нее смесь двух окрашенных компо­нентов — высокомолекулярного с коэффициентом разделения К = 0 и низкомолекулярного с К_р = 1. При этом преследуют две цели: определить параметры колонки (У_н. У_в) и проверить каче­ство ее заполнения. Параметры определяют по форме и степени компактности окрашенных зон. В качестве высокомолекуляр­ного окрашенного вещества обычно используют голубой декст- ран — линейный водорастворимый полиглюкан молекулярной массой около 2 000 000 Да, несущий ковалентно присоединенные хромофорные группы. Низкомолекулярным окрашенным соеди­нением служит какая-либо соль, содержащая окрашенные катио­ны (кобальт, никель) или анионы (бихромат).

Калибрование проводят следующим образом. Открывают кран колонки так, чтобы жидкость вытекала медленно (5—7 капель в минуту), и дают раствору, находящемуся над поверхностью геля, почти полностью впитаться. Под колонку помещают мерную про­бирку для сбора элюата. На поверхность геля наносят 0,2—0,3 см³ водного раствора голубого декстрана и окрашенной соли. Насла­ивание проводят осторожно, по каплям, по всей поверхности геля. Затем открывают кран и дают раствору проникнуть в гель. Кран закрывают и на поверхность геля осторожно наслаивают 0,2 см³ элюента и опять, открывая кран, дают войти этому раствору в гель. Операцию повторяют еще два раза. Как только окрашенные зоны начнут передвигаться по столбику сефадекса, свободную часть колонки заполняют элюентом, а затем в ходе элюирования его уровень поддерживают примерно постоянным, заполняя ко­лонку почти доверху. Поддерживая с помощью крана низкую ско­рость элюирования (5—10 капель в минуту), собирают элюат пор­

107

циями по 2 см-¹ в пронумерованные мерные пробирки. В процессе элюирования визуально оценивают качество заполнения колонки: при однородном заполнении и сохранении горизонтальной по­верхности геля окрашенные соединения (особенно голубой декст- ран) перемещаются по столбику сефадекса в виде компактных не­перекрывающихся зон.

По окончании элюирования всех окрашенных веществ кран колонки закрывают и проводят колориметрирование окрашенных фракций элюата: фракции, содержащие голубой декстран, — с красным светофильтром, а фракции, содержащие бихромат, — с зеленым. Затем строят график элюирования при калибровании колонки, откладывая на оси абсцисс номера фракций (или объем в см³), а на оси ординат — значения экстинкций. На графике от­мечают величины V_u и

Для разделения белков на колонке с сефадексом подготов­ленную пробу осторожно, с учетом вышеприведенных рекоменда­ций наносят на колонку пипеткой и отмечают время начала опы­та. После проникновения пробы в среду сефадекса подключают элюирующий раствор.

Вытекающий из колонки буферный раствор собирают в пробирки порциями по 1—3 см³. Объем элюата, прошедший через колонку, ре­гистрируют, начиная с момента нанесения образца на колонку.

Содержание белка во фракциях определяют спектрофотомет- рически при длине волны 280 нм.

По окончании анализа колонку промывают несколькими объе­мами буферного раствора. Строят профиль элюирования отдель­ных белковых фракций (рис. 1.29). При этом на оси абсцисс от­кладывают номера пробирок (фракций) или объем прошедшей через колонку жидкости, а на оси ординат — значения оптической плотности фракций. Белки, принадлежащие к одной фракции (пик на профиле элюирования), объединяют. О числе белковых фракций судят по количеству пиков на графике. Количественное определение белка ведут по калибровочному графику.

£ 0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

О

VI

XI

Номер пробирки

Рис. 1.29. Пример графика элюирования при фракционировании белков:

с I по XI— белковые фракции

108

Построение калибровочного графика. Для количественного определения белка спектрофо- тометрическим методом пред­варительно строят калибровоч­ный график с использованием раствора чистого белка концен­трацией от 0,05 до 2,00мг/см\ пример которого приведен на рис. 1.30.

Полученные результаты ре­комендуется оформить в ви­де графика элюирования (см. рис. 1.29) и таблицы резуль­татов, форма которой приве­дена ниже.

Рис. 1.30. Пример калибровочного гра­фика для определения концентрации белка в растворе спектрофотометричес- ким методом

Образец	Масса навески, г	Количество бел­ковых фракции	Массовое содержание белков
			суммарное	каждоП из фрак­ций

После этого студенты делают самостоятельные выводы и за­ключение по работе, акцентируя внимание на полученных экс­периментальных данных и их сравнительной оценке с данными литературы.

Лабораторная работа № 14

АНАЛИЗ БЕЛКОВ МЕТОДАМИ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Цель работы. Приобрести практический навык при анализе белков методами ионообменной хроматографии.

Задачи. Подготовка проб, ионообменной смолы и хроматогра- фической колонки к анализу, разделение белков, расчет количе­ства белка в анализируемых материалах.

Объекты исследования. Кровь и ее фракции, а также мясо раз­личных видов животных и птицы, мясопродукты.

Методические указания. Перед использованием ионитов для хроматографического разделения белков их предварительно обра­батывают. Иониты промышленного изготовления после набуха­ния, во-первых, фракционируют по размеру частиц (однород­ность частиц сорбентов по размеру — одно из важных условий успешной хроматографии) и, во-вторых, подвергают «циклиза-

109

>uut • - перевод» п\ и о д ж > и формы в др\тую. Каыоншы перст-' ли 1 и i\a -формм i- И " форм\ или наоборот, а аниониты из v i -фо[).мы и ОН -форм\ или наоборот. В процессе обработки стабилизируется структура ионита. и функциональные группы становятся более доступными. Одновременно ионит освобождает­ся от примесей.

Ионообменники можно использовать многократно. Поэтому по окончании работы их следует регенерировать. Для этого к ис­пользованному сорбенту добавляют 30-кратный объем раствора NaOH молярной концентрацией 0,2—0,5 моль/дм\ перемешива­ют до получения однородной суспензии и фильтруют на воронке Бюхнера. Обработку щелочью проводят дважды. После этого ионит промывают водой до нейтральной реакции фильтрата. Ре­генерированный ионообменник уравновешивают соответствую­щим буферным раствором.

Ионообменники на основе целлюлозы можно хранить во влажном состоянии непродолжительное время. Аниониты лучите хранить в солевой форме (не в ОН -форме), а катиониты — в со­левой и в Н⁺-форме. При хранении набухших ионообменников рекомендуется добавлять толуол. При добавлении толуола (не­сколько капель на 1 дм³) следует помнить, что толуол погло­щает электромагнитные волны при 280 нм, а растворимость его в некоторых буферных растворах, например в трис-буфере, до­статочно высока.

В целом же следует отметить, что ионообменная хроматогра­фия белков менее предпочтительна, чем гель-фильтрация.

В работе в качестве ионита рекомендуется использовать диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу) и (или) кар- боксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлозу). ДЭАЭ-целлюлоза бла­годаря своим функциональным группам — диэтиламиноэтиль- ным остаткам [—СН₂ — СН₂ — N = (С₂Н₅)^] в водном растворе обладает свойствами слабого анионита; используется для хро- матографического фракционирования кислых и нейтральных белков. Фракционирование белков сыворотки крови можно проводить с использованием градиентного или ступенчатого элюирования. Сорбцию белков на колонке осуществляют при рН 5,65. При этом значении рН белки сыворотки крови могут сорбироваться на слабых анионитах.

Карбоксиметилцеллюлоза — слабый катионит, содержащий в качестве ионогенных групп карбоксиметильные остатки СН₂ — СОО~, связанные с гидроксильными группами целлюлозы эфирными связями. Используется для разделения основных и нейтральных белков.

Фракционирование белков сыворотки крови на КМ-целлюлозе рекомендуется проводить путем создания ступенчатого элюирова­ния. Это обусловлено достаточно большими различиями в срод­стве отдельных белковых фракций к иониту. Сорбция белков на

ПО

колонке ос\щеел вляе гея при рИ --!.(> (<-сшрюьыл буфер») При га ком значении рН белки сыворотки крови еорбирчкнея на слабых катионитах.

Подготовка проб. Для подготовки рекомендуется использовать следующие способьв Для получения сыворотки 2—3 см-¹ крови по­мешают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 0.5—1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробир­ки для отделения сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку. С целью удаления солей ее диализируют против исходного буферного раствора. Для этого сыворотку разводят два раза исходным буферным раствором, помещают в специальный мешок и диализируют против того же буфера в течение не менее 12 ч (можно оставлять на ночь); при использовании в качестве объекта мяса белки предварительно экстрагируют согласно описи методов, указанных в лабораторной работе № 3.

1. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА ДЭАЭ-ЦЕЛЛЮЛОЗЕ

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор НСЛ молярной концентрацией 0,5 моль/дм³; раствор NaOH молярной концентра­цией 0,5 моль/дм³; ДЭАЭ-целлюлоза; натрий-ацетатный буфер — растворы молярной концентрацией 0,02; 0,1 и 0,5 моль/дм³ (рН 5,6); раствор NaCl молярной концентрацией 0,3 моль/дм³, приготовленный на натрий-ацетатном буфере молярной концен­трацией 0,02 моль/дм³; раствор NaCl молярной концентрацией 0,5 моль/дм³, приготовленный на натрий-ацетатном буфере мо­лярной концентрацией 0,5 моль/дм³.

Порядок проведения анализа. Для подготовки сорбента берут около 10 г ДЭАЭ-целлюлозы, обрабатывают и переводят в ОН~-фор- му. После удаления мелких и крупных частиц ДЭАЭ-целлюлозу суспендируют дважды в избытке натрий-ацетатного буферного раствора (0,1 моль/дм³, рН 5,65), выдерживая каждый раз в буфере по 30 мин. Избыток жидкости удаляют декантацией. После второ­го суспендирования смесь вносят в колонку.

Рекомендуемый размер колонки 1,5x20 см. По окончании за­полнения колонки ионит уплотняют либо поршнем, либо давле­нием воздуха до получения постоянной высоты столба геля. За­тем колонку уравновешивают исходным элюирующим буферным раствором — натрий-ацетатным буфером молярной концентраци­ей 0,1 моль/дм³ (рН 5,6), медленно пропуская его через колонку (при данных размерах колонки 5—6 капель в 1 мин) до тех пор, пока рН выходящего из колонки раствора не будет равен исходно­му. Объем раствора, необходимого для уравновешивания, состав­ляет около 8 общих объемов колонки. Затем на колонку наносят 50—100 мг белка в объеме 1—3 см³. Пробу вводят микропипеткой

ИЛИ М И КрО! 11 И ПИ НС М . Л'1Я ЧСГО ОТСОСДИНЯКЛ КаПСЛЬНХ'К") ВороНКУ. Но кран ьоронкп нс закрывают, чтобы не прекратить поток жидко­сти. Смесь разделяемых веществ подают в колонку в гот момент, когда слой растворителя над сорбентом опустится до верхней его границы. Затем сверху осторожно наливают растворитель на высо­ту 1—2 см над поверхностью сорбента и поддерживают этот уро­вень. Колонку промывают исходным буферным раствором до ге\ пор, пока оптическая плотность элюата не станет равной пример­но 0.05, после чего переходят к фракционированию белков.

Скорость протекания белков через колонку не должна пре­вышать 15—20см³/ч. Элюат собирают порциями по 3 см³. Элюирование белков с колонки проводят буферными раствора­ми с линейным градиентом NaCl, меняя молярную концентра­цию последнего от 0 до 0,3 моль/дм³. Прибор для создания ли­нейного градиента представлен на рис. 1.9, а. В смеситель поме­щают 250 см³ натрий-ацетатного буфера (0,02 моль/дм³, рН 5,6), а в сосуд 1—250 см³ этого же раствора, но содержащего раст­вор NaCl молярной концентрацией 0,3 моль/дм³. Наиболее прочно адсорбированные белки дополнительно элюируют раст­вором NaCl молярной концентрацией 0,5 моль/дм³ в ацетатном буфере (0,5 моль/дм³, рН 5,6).

Элюаты в пробирках анализируют на спектрофотометре при дай­не волны 280 нм. На основании данных, полученных при определе­нии содержания белка в отдельных порциях элюата, строят профиль элюирования, определяют число белковых фракций и рассчитывают массовое содержание белка (см. лабораторную работу № 2).

2. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА КМ-ЦЕЛЛЮЛОЗЕ

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор НС1 молярной концентрацией 0,5 моль/дм³; раствор NaOH молярной концен­трацией 0,5 моль/дм³; КМ-целлюлоза; натрий-ацетатный бу­фер — растворы молярной концентрацией 0,02 (рН 4,6), 0,05 (рН 5,2) и 0,08 моль/дм³ (рН 6,0); фосфатный буфер — раствор молярной концентрацией 0,1 моль/дм³ (рН 7,0); фосфатный бу­фер—раствор молярной концентрацией 0,1 моль/дм³, приго­товленный на растворе поваренной соли молярной концентра­цией 0,5 моль/дм³ (рН 8,3).

Порядок проведения анализа. Для подготовки сорбента берут около Юг КМ-целлюлозы, обрабатывают и переводят в Н⁺-фор- му. Гранулярную или волокнистую КМ-целлюлозу рекомендует­ся отмывать после обработки кислотой или щелочью фильтрова­нием на воронке Бюхнера или центрифугированием, сферичес­кую — декантацией в химическом стакане. В случае необходимос­ти КМ-целлюлозу фракционируют по размеру частиц.

112

1 liuioiOBKa и .аполнснис колонки размером i • Н¹ ем онисл иы в п. 1. ланнои работы. Используют исходный t<-с iар;овыи->) бу­ферный раствор -- натрии-а!ie ia i шли буфер молярной копнен тра- Li 11 е i 1 0.02 моль/л м-' (рН 4.(я.

На колонку наносят 70—100 \н белка в объеме 1 —3 см\ Колон­ку промывают псчолным буферным расiвором до гех нор. пока оптическая плотность элюата не станет paBnoii 0.02.

Фракционирование бет ков сыворотки крови на KM II осуще­ствляют с помощью ступенчатого элюирования (см. рис. 1.8). по­давая на колонку последовательно следующие растворы: натрий- ацетатный буфер («стартовый буфер») (0,02 моль/дм¹. рН 4,6): натрий-ацетатный буфер (0,05 моль/дм \ рН 5.2): натрий-аце­татный буфер (0.08 моль/дм³, рН 6.0): фосфатный буфер (0,1 моль/дм³, рН 6,0) и фосфатный буфер (0.1 моль/дм³, рН 8,3), содержащий раствор NaCl молярной концентрацией 0,5 моль/дм³. Каждый новый раствор подают на колонку только после того, как полностью элюируется пик. вымываемый предыдущим раствором. Скорость тока приблизительно составляет 50 см³/ч. Элюат собира­ют порциями по 2—3 см³.

Элюаты в пробирках анализируют сгтектрофотометрически при длине волны 280 нм. На основании данных, подученных при определении содержания белка в отдельных порциях элюата, строят профиль элюирования, определяют число белковых фрак­ций и рассчитывают массовое содержание белка фотометрически (см. лабораторную работу № 2).

Полученные результаты используют для построения профиля элюирования белков и расчетов количества белка в пиках. После этого рекомендуется самостоятельно сформулировать выводы и заключение по работе, акцентируя внимание на полученных экспе­риментальных данных и сравнивая их с данными литературы.

Лабораторная работа № 15

АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ НА АВТОМАТИЧЕСКОМ АМИНОКИСЛОТНОМ АНАЛИЗАТОРЕ

Цель работы. Приобрести практический навык определения состава аминокислот в белках мяса и мясопродуктов на автома­тическом аминокислотном анализаторе.

Задачи. Изучить конструкцию прибора и принципы его рабо­ты; провести гидролиз анализируемых образцов; получить ами- нограммы после разделения смеси аминокислот с последующим расчетом их количества.

Объекты исследования. Мясо и мясопродукты.

Материалы, реактивы и оборудование. Соляная кислота моляр­ной концентрацией 6 моль/дм-⁵: буферные растворы рН 2,2: 3,28:

ИЗ

4.25. 5.28; смесь муравьинои. уксусной кислоi п воды и cooi- ношении 7:5: 15; аминоанализатор: полянам баня, испаритель; стеклянные пипетки; стеклянные палочки: стаканы: фарфоро­вая чашка.

Приготовление реактивов. Б у ф е р н ы и р а с т в о р л л я на­несения образца (рН 2,2). 11.6 г хлорида натрия и 0.8 см-¹ концентрированной соляной кислоты растворяют в 1 дм³ дистил­лированной воды.

Буферные растворы для э л ю и р о в ан и я а м и - нокислот (рН 3,28: 4,25: 5.28). Количественное соотношение компонентов указано в таблице, приведенной ниже.

Состав буферных растворов		рН
	3.2S	4,25	5,28
Лимонная кислота одноводная. г	70.5	282.5	123,0
Соляная кислота (плотность	61,6	167.5	32,5
1190 г/см3), см1
Гидроксид натрия, г	40,0	160,0	70,0
Этанол, см3	200,0	-	-
Детергент (барий 35). г	10,0	10,0	10,0
Вода, см3	До 5000	До 5000	До 5000

Методические указания. Состав аминокислот в белках различ­ных мясных продуктов определяют методом ионообменной хро­матографии на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-881 (Чехия) или на каком-либо другом. Для разделения ами­нокислот применяют хроматографическую колонку, заполненную катионообменной смолой, со ступенчатым элюированием тремя натрий-цитратными буферными растворами с различным значе­нием рН (3,28; 4,25; 5,28).

Метод включает обязательный предварительный гидролиз белков кислотой или щелочью с целью получения свободных аминокислот. Их затем определяют с помощью ионообменной хроматографии на колонках, заполненных твердым носителем, химически соединенным с заряженными группами, которые обеспечивают электростатическое взаимодействие с исследуе­мым объектом.

Аминокислоты исследуемого раствора обратимо связываются ионообменником, а затем элюируются буферным раствором, вы­зывая десорбцию аминокислот. Для элюирования аминокислот используют буферные растворы, рН и ионная сила которых по­степенно повышаются. При этих условиях аминокислоты выхо­дят на колонки в следующем порядке: кислые, нейтральные и основные.

114

Рис. 1.31. Схема автоматичес­кого аминокислотного анали­затора:

сис1сма подачи образна; 2. 2', 2" — сосуды с буферными растворами; .?. 6— насосы; 4 — ионообменная колонка; со­суд с раствором нингидрина; 7 — смеситель; 8 — капилляр; 9 — спектрофотометр; 10 — са- могшсеп

1

3

9

10

Принципиальная схема аминокислотного анализатора пред­ставлена на рис. 1.31.

Выходящий из колонки элюат поступает в смеситель, содер­жащий нингидрин, который подается насосом. Для развития цветности в результате качественной реакции смесь проходит че­рез специальный капилляр, погруженный на водяную баню тем­пературой 100 °С. Окрашенный раствор пропускают через спект­рофотометр с длиной волны 570 нм для измерения интенсивнос­ти окраски, которая фиксируется самописцем в виде пиков. По расположению пиков судят о наличии индивидуальных амино­кислот в гидролизате, а по площади пиков — об их содержании. Пример хроматограммы аминокислот (аминограммы) приведен на рис. 1.32. Для расчетов необходимо предварительно получить стандартную аминограмму.

1 ■ г~— j 1 ■ Буферный раствор 2

•1 г г~-■;" Буферный раствор 2 '

1—■ 1 т 1—- Буферный раствор 2 -

1

1

со

=3

с. <

- Ко - J t г.-

5

-s . с

С5. 5

п

Арг

и ir .

<о. 1 ■. <s>.

<2 8-

а:

Г.

;' с

а а.

— п.. 1

> ■:'

\ ; \ / — ч.

\ „

г" j\0 i ' 1 ' V-

—

—У- г

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 Продолжительность элюирования, мин

Рис. 1.32. Хроматограмма аминокислот

115

По.иотовка проб. При определении суммарных амннокие.вн «свободных и связанных) проводят пиролиз белков п пептидов, содержащихся в мясо. Для этого образец измельченного мяса мас­сой 150—250 мг (белка должно быть не менее 25—50 мг) помешают в стеклянные ампулы или термостойкие пробирки с пришлифован­ными пробками и добавляют 25 см-' раст вора соляной кислоты мо­лярной концентрацией 6 моль/дм-. Затем ампулы запаивают (или плотно закрывают пробирки пробками) и выдерживают в термоста­те при 114—115 С в течение суток. При этом необходимо помнить, что при кислотном гидролизе триптофан разрушается полностью, серии и треонин — на 5 — 10%, цистин, цистеин, метионин — час­тично. Перед гидролизом образцы следует пометить. Приготовлен­ные пробы устанавливают в термостат и оставляют под наблюдение и контроль лаборанта до следующего занятия.

На втором этапе по окончании гидролиза образец фильтруют через стеклянный фильтр, испаряют избыток соляной кислоты. Для этого 5 см³ гидролизата помещают в роторный испаритель и упаривают досуха при температуре 40 °С. После этого в сухой оста­ток приливают 1,5 см³ дистиллированной воды и снова упаривают, повторяя операцию дважды. Освобожденный от соляной кислоты остаток растворяют в 10 см³ буферного раствора (рН 2,2).

При определении только свободных аминокислот предваритель­но получают безбелковые экстракты тканей или продуктов.

Экстракт мышечной ткани получают в соответствии с описа­нием, указанным в лабораторной работе № 2. После упарива­ния на роторном испарителе сухой остаток растворяют в смеси НСООН—СН₃СООН—Н₂0 в соотношении 7:5:13с таким расче­том, чтобы 1 см³ раствора соответствовал 1,5—2,0 г ткани.

При определении аминокислот в жидких материалах, напри­мер в крови убойных животных и ее фракциях, к 1—2 см³ образца добавляют равный объем раствора СН₃СООН молярной концен­трацией 0,04 моль/дм³, нагревают на водяной бане, доводят до кипения и кипятят 2—3 мин, охлаждают и осадок белка отделяют центрифугированием. Центрифугат сливают и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 0,1—0,2 см³ смеси муравьиной, ук­сусной кислот и воды (7:5: 13), нерастворившийся осадок от­брасывают.

Порядок проведения анализа. Раствор анализируемого материала объемом 0,5 см³ вручную или с помощью насоса вводят в колонку и запускают систему. Продолжительность собственно анализа 5—6 ч (время регламентируется конструкционными особенностями ами­нокислотного анализатора). Строят аминограмму.

Построение стандартной аминограммы. Перед хроматографичес- ким разделением опытных образцов для получения стандартной хроматограммы проводят анализ стандартной смеси аминокислот. Причем смесь аминокислот готовят так, чтобы молярная концен­трация каждой аминокислоты была равна 1 ммоль/дм³. Для этого

116

навеску каждой	ам	пнокисдоIы	(ми бер\ 1 1	5 КОЛ И чес! ВС.	числен 1
равном ее молекул		ярноп массе.	Кроме i oi о. бер\ г coo i		ветствхт
тую навеску хлор!		1да аммония	лля пол\че	нпя ciaiuapi	НО! о пи
аммиака, который		образуется в	гидролиза	re в результа	re рас па
амидов, содержа	IIIU	1.\ся 15 белках
Приготовлен:	ие	стандартного раствора ;		аминокислот	рекоме
дуется проводит	В 15	соответствш	I с данным!	,i таблицы:
Ампнокисло1 л		Oi постельная ! молекулярная j	Массовая лоля il Ю'1 Л (	Содержание н ! см	!' рас I нора.
		масса j		аминокис.кпы j	азом
Лизин		146.13	19.17	0.14613	0.02801
Гистидин		155.19	27.10	0.15519	0.04206
Аргинин		174.24	32.18	0.17424	0.05604
Аспарагиноная кис­		133.12	10,53	0.13312	0.01402
лота
Треонин		119,12	1 1.75	0.11912	0.01400
Серин		105.09	13.33	0,10509	0.01401
Глутаминовая кис­		147.12	9.52	0.14712	0.01401
лота
Пролин		115,12	12,17	0.11512	0.01401
Глицин		75.05	18.67	0,07505	0.01401
Алании		89.12	15,73	0,08912	0.01402
Цисте и н		121.15	11.56	0.12115	0.01389
Валин		117,09	11.96	0.11709	0.01401
Метионин		149,20	9.39	0,14920	0,01401
Изолейцин		131,20	10.60	0.13120	0.01401
Лейцин		131,20	10,60	0.13120	0,01401
Тирозин		181.19	7,74	0,18119	0,01403
Фенилаланин		165,19	8.48	0,16519	0.01403
Хлорид аммония		53,49	26,16	0.53449	0,01401

Изучают полученную аминограмму. Измеряют площади пиков с помощью потенциометра или вычисляют путем ум­ножения высоты пика на его ширину, взятую на половине его высоты.

Массовую долю аминокислот рассчитывают по формуле

X=(S_nM-50- (1-24)

где S_n — площадь пика соответствующей аминокислоты на полученной амино- грамме, см²; М— молекулярная масса аминокислоты. Да; 50 — объем раствора, полученный после кислотного гидролиза, см³; 10"^-3—концентрация аминокисло­ты в стандартном растворе, моль/дм³; — площадь пика стандартного раствора аминокислоты, см-; т — масса навески образца, г.

117

Содержание аминокислот и мышечной ткани ныражаюг и мик­ромолях. миллиграмм-проиентах на влажную массу ткани или в процентах к небелковому или общему азоту, в сыворотке крови — в микромолях, миллиграмм-процентах или в процентах к небел­ковому азоту.

Полученные экспериментальные и расчетные данные сводят в таблицу, форма которой приведена ниже.

Наименование п харак терпетика образна

Содержание амннокисло! в образце

мкмолв/дм'"

МГ,г

Сравнив данные с действующими научно обоснованными нор­мами питания, полезно проанализировать потенциальные воз­можности сырья или продуктов для покрытия суточной потреб­ности в незаменимых аминокислотах, дать рекомендации по ра­циональному их использованию.

Лабораторная работа № 16

АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Цель работы. Приобрести практический навык анализа амино­кислот мяса и мясопродуктов методами бумажной хроматографии.

Задачи. Подготовить хроматографические камеры и пробы для хроматографирования, проявить бумагу и идентифицировать аминокислоты.

Объекты исследования. Мясо, мясопродукты, кровь и ее фракции.

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор НСЮ₄ моляр­ной концентрацией 0,5 моль/дм³; раствор КОН молярной кон­центрацией 5 моль/дм³; раствор нингидрина в ацетоне массовой долей 0,2 %; стандартные растворы аминокислот молярной кон­центрацией 0,025 моль/дм , этанол (на 50 см³ этанола добавляют 0,02 см³ насыщенного раствора CuS0₄); раствор изопропанола массовой долей 10 %; диазореактив; хроматографические каме­ры; бумага; пульверизатор; ножницы; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр.

Приготовление реактивов. Бутанолуксусная смесь. Смесь нормального бутанола, уксусной кислоты и воды в соотно­шении 4:1:5 (верхний слой) и 8 : 3: 1 (нижний слой) тщательно встряхивают в делительной воронке и после расслаивания исполь­зуют верхний слой.

118

Л и а з о р е а к г и и: смешивают о uni объем раствора суль- фанпловой кислоты (к 0.9 г кислоты прибавим-. 9 см ' концен­трированной НС1 и 90 см¹ П.О) и пять объемов свежеприготов­ленного раствора NaNO. массовой долей 5 ^гс. объем доводят во­дой до 50 см³.

Методические указания. Метод основан на распределении со­единения между двумя жидкими фазами. Хроматографическая бу­мага обладает свойством поглощать воду из атмосферы и задержи­вать ее между своими целлюлозными волокнами. Эту воду мож­но рассматривать как один из растворителей (как неподвижную фазу). Когда по бумаге под действием капиллярных сил движет­ся неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в со­ответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше раст­воримость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продви­нется по бумаге вместе с растворителем, и наоборот.

Как правило, при бумажной хроматографии неподвижная фаза является водной, а в качестве подвижной используются органи­ческие растворители.

Метод хроматографического разделения на бумаге уступает ко­лоночным методам по ряду показателей, однако имеет в ряде слу­чаев определенное преимущество.

Определение свободных аминокислот сводится к хроматографи- ческому анализу безбелковых фильтратов на бумаге и определению аминокислот после обработки хроматограмм нингидрином.

В присутствии нингидрина отдельные аминокислоты прояв­ляются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый, жел­тый или другой цвет (в зависимости от химической структуры аминокислоты).

Идентификацию аминокислот в смеси проводят путем сопостав­ления распределения известных аминокислот (стандартов).

Подготовка проб. 1. Суммарные аминокислоты получают путем предварительного гидролиза (см. лабораторную работу № 15).

2. Свободные аминокислоты извлекают из образцов раствором спирта (75—80 об.%), нагретого до температуры 60—70 °С на водя­ной бане. Полученную смесь тщательно растирают в течение 15 мин и фильтруют через вставленный в воронку складчатый фильтр в чашку для выпаривания, которую используют в качестве приемника.

Порядок проведения анализа. Для анализа используют хромато- графическую бумагу ватман № 1, FN № 3 (можно № 2) и др. Вы­резают полосы длиной около 50 см и шириной 18—50 см (размер бумаги определяется размером исследуемых проб и величиной хроматографической камеры). В 5—10 см от конца полоски (зави­сит от высоты лодочки) простым карандашом проводят стартовую линию и отмечают точки нанесения раствора в 3 см от краев хро­матограммы и в 2,5 см одна от другой. Для лучшего разделения об-

119

I'stc 1.33 Форма бумажной полосы, обеспечивающая л>ч шее раз имение ачинокисло! (размеры лапы в мм):

разной с большим набором аминокислот крап бумаги, на который наносят гидролизат. выре­зают. как это показано на рис. 1.33.

Чашку с экстрактом помещают на водяную баню при температуре кипения и полностью выпаривают спирт. Полученный сухой остаток растворяют в растворе изопропанола массовой долей 10 % с таким расчетом, чтобы 1 см³ раст­вора соответствовал 1,5—2 г ткани. Раствор на­носят на хроматограмму в количестве, эквива­лентном 30—50 мг ткани. На ту же хромато­грамму рядом с исследуемым раствором нано­сят растворы известных аминокислот — «сви­детелей». Стандартные растворы глутаминовой кислоты и аланина (или любых других амино­кислот) наносят в отдельные точки (обычно 3—5 точек) в строго определенном количестве. По этим точкам строят стандартные калибровочные графики для количественного определения ами­нокислот в экстракте ткани.

Построение калибровочного графика. Для каждой аминокислоты строят свой калибровочный график. В ряд точек хроматограммы наносят стандартные растворы аминокислот в количестве 0,05; 0,1; 0,15 и 0,2мкмоль каждой. В качестве стандартных растворов удобно пользоваться смесями аминокислот известного состава, хорошо разделяющимися в данных условиях и содержащими оп­ределенные количества аминокислот. Стандартные смеси готовят из стандартных растворов отдельных аминокислот молярной кон­центрацией 0,025 моль/дм³, приготовленных на растворе изо- пропилового спирта массовой долей 10%, смешиванием по 1 см³ (0,5 см³) раствора каждой аминокислоты. Стандартные растворы аминокислот наносят на ту же хроматограмму, что и опытные пробы. Если размеры хроматограммы не позволяют этого, полос­ки бумаги, используемые для хроматографии стандартных и опыт­ных растворов, вырезают из одного и того же листа хроматографи- ческой бумаги.

После проявления хроматограммы окрашенные участки обво­дят простым карандашом, вырезают, измельчают ножницами и помещают в пробирки. Окрашенный продукт элюируют 5 см³ пе­регнанного метанола (предварительно к 500 см³ метанола добавля­ют 0,2 см³ насыщенного раствора нитрата меди) или 5 см³ этило­вого спирта (в этом случае вместо нитрата меди добавляют суль­

120

фат моли). Пробы ло колорпметрпрования необходимо не риодпчески встряхивать и держать в гемноге. Элюаты начинаю! кодориметрировать. когда is раствор перейдет краска из наибо­лее интенсивно окрашенных пятен (обычно через 30—60 мин). Определение проводят на фотоэлектроколорпметре с зеленым светофильтром (500 нм) в кювете толщиной 0.5—1.0 см. Для контроля вырезают чистый участок хроматограммы на том же уровне, что и проявленные пятна, и обрабатывают его так же. как и опытные пробы.

Калибровочный график строят, откладывая на оси абсцисс концентрацию аминокислоты, а на оси ординат — величины оп­тической плотности.

Исследуемый раствор наносят микропипеткой с оттянутым в капилляр и изогнутым концом вместимостью 0,1 см³, полуавто­матической пипеткой или калиброванным капилляром. Диаметр наносимых пятен не должен превышать 0,3—0,5 см (объем каж­дой капли около 0,003—0,005 см³). При нанесении раствора в одну и ту же точку бумаги соответствующее место каждый раз подсушивают током теплого воздуха. Если расстояние между точками нанесения превышает 2,5 см, раствор можно наносить в виде полосы.

Для идентификации аминокислот в исследуемом гидролизате наряду с опытными пробами (или предварительно, до анализа опытных проб) на хроматограмму наносят растворы аминокис­лот — «свидетелей». После установления местоположения пятен отдельных аминокислот — «свидетелей» в дальнейшем последние можно наносить на хроматограмму в виде смесей. Смеси должны иметь известный состав и хорошо разделяться при данных услови­ях хроматографирования. Этим требованиям удовлетворяют смеси аминокислот следующего состава:

1. Цистеиновая кислота, гистидин, аспарагиновая кислота, гли­цин, глутаминовая кислота, аланин, триптофан, метионин, фе- нилаланин, лейцин.

2. Цистеиновая кислота, лизин, аргинин, серин, треонин, ала­нин, пролин,тирозин, валин, изолейцин.

Смеси «свидетелей» помещают в крайние точки стартовой линии хроматограмм по 0,05—0,1 мкмоль каждой аминокисло­ты в пятно.

В качестве растворителей для хроматографии аминокислот обычно используют последовательно две системы: w-бутанол — уксусная кислота — вода в соотношении 4:1:5 (верхний слой) и ft-бутанол — уксусная кислота — вода в соотношении 8:3:1.

Для лучшего разделения сложной смеси аминокислот, имею­щих близкие величины R_f, каждый растворитель пропускают по хроматограмме несколько раз (обычно дважды). В этом случае фронт каждого последующего растворителя должен продвигать-

121

сvi несколько да.лапе. чем предыдущего. Перед использованием каждою слел\тоше[ с» рас твори тел я хрома i oi раммы вынимаю i из камеры и сушат на воздухе.

Хромаз oi рамму проявляю! раствором нингидрина массовой долей 0.2 ^С:с. приготовленным на перегнанном ацетоне. К раствору нингидрина прибавляют 4 см-' воды и 1 см¹ ледяной уксусной кис­лоты. Этот раствор готовят непосредственно перед проявлением. Раствор наливают в ванночку и равномерно пропитывают им хро­матограмму. Затем ее сушат под тягой и выдерживают в темноте при комнатной температуре около 12 ч. В этих условиях с нин- пщрином реагируют все (/-аминокислоты (все другие аминокис­лоты дают реакцию при более высокой температуре — около 100 °С). Проявление хроматограмм при качественной хромато­графии можно ускорить, помещая последние на 10—15 мин в тер­мостат при 60 °С. Окраска, полученная при проявлении амино­кислот нингидрином, неустойчивая. Ее можно закрепить, опрыс­кивая проявленную хроматограмму из пульверизатора раствором ацетона, содержащим нитрат меди. К 100 см³ ацетона прибавляют 1 см³ насыщенного раствора Cu(NO.)-, и 0,02 см³ концентрирован­ной азотной кислоты.

Сопоставляя положение аминокислот гидролизата с положени­ем аминокислот — «свидетелей», определяют аминокислотный со­став гидролизата.

Наряду с нингидриновым реактивом существуют и другие реактивы, дающие цветные продукты с некоторыми аминокис­лотами. Это свойство избирательного окрашивания часто исполь­зуют в хроматографии для идентификации отдельных аминокис­лот. Так, для определения соединений с гуанидиновой группой (аргинин) используют реакцию Сакагуши. Хроматограмму смачи­вают раствором 8-оксихинолина в ацетоне с массовой долей 0,1 % и после ее подсушивания на воздухе слегка опрыскивают из пульверизатора раствором гипобромита (1см³ брома в 500 см³ раствора NaOH молярной концентрацией 0,5 моль/дм³). Наблю­дается оранжевое окрашивание.

Реакция Эрлиха. Производные индола и оксииндола (трипто­фан, 5-окситриптофан, 5-окситриптамин, 5-оксииндолуксусная кислота) с реактивом Эрлиха дают лиловую окраску. Хромато­грамму погружают в раствор, содержащий диметиламинобензаль- дегид массовой долей 10 % в концентрированной НС1 с четырьмя объемами ацетона. Окраска появляется через 20 мин при комнат­ной температуре.

Реакция Паули. Соединения, содержащие имидазольное кольцо (гистидин, метилгистидин, гистамин, карнозин), а также тирозин дают красно-оранжевое окрашивание после обработки диазореак- тивом. Хроматограмму из пульверизатора слегка опрыскивают сначала диазореактивом, а затем раствором Na₂C0₃ массовой до­лей 10 %. Окраска устойчивая.

122

Перечисленные реакции можно применяй, посте проявление хроматограммы нпнгилрином.

Для обнаружения материала, имеющего пептидные связи, по не дающего нингпдриновую реакцию (например, циклические пептиды), применяют реакцию Райдона и Смита. С этой иелыо хо­рошо высушенную хроматограмму смачивают в смеси спирта it эфира (1 : 1). Избыток растворителя удаляют фильтровальной бу­магой. Влажную хроматограмму помещают в замкнутое простран­ство над свежеприготовленно!'] смесью раствора НС1 массовой до­лей 10 % и раствором КМп0₄ массовой долей 1 % (в соотноше­нии 1 : 1) на 5—15 мин. Затем хроматограмму погружают в смесь раствора KJ молярной концентрацией 0.05 моль/дм³ и насыщен­ного раствора о-толуидина (или бензидина) в уксусной кислоте массовой долей 2 % (1 : 1). На месте пептидов и белка появляются синие пятна. Через 1—3 мин хроматограмму промывают раство­ром СН₃СООН массовой долей 2 % и высушивают на воздухе. Ок­раска устойчивая. Для пептидов эта реакция более чувствительна, чем нингидриновая. Реакцию дают также пуриновые и пиримиди - новые основания, нуклеозиды, нуклеотиды и др.

Количественное содержание аминокислот рассчитывают по калибровочным графикам, построенным после хроматографиро- вания стандартных растворов аминокислот, взятых в различных количествах.

Содержание аминокислот в мышцах рассчитывают в микромо­лях, миллиграмм-процентах на массу ткани или процентах к не­белковому или общему азоту.

Полученные экспериментальные и расчетные данные оформ­ляют в виде таблицы. Самостоятельно анализируют их и формули­руют выводы по работе.

Наименование и характе­ристика образца	Качественный состав аминокислот	Количество аминокислот

Лабораторная работа №17

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

НА ПЛАСТИНАХ

Цель работы. Приобрести практический навык количественно­го определения аминокислот методом тонкослойной ионообмен­ной хроматографии на пластинах.

Объекты исследования. Мясо и мясопродукты.

Материалы, реактивы и оборудование. Хроматографические пластины, уравновешивающий буферный раствор (рН 4,1); разде-

123

ляюшпе буферные рпспюры (рМ 3.?: 5,23: 6.0); кадмпп-нпнгпл- риновый прояви 1ель: хрома i oi рафическая камера: пульверизатор: микропипетки: сушильный шкаф.

Приготовление реактивов. V р а в н о в е ш и в а ю щ и ii 6 у - ф е р н ы й р а е т в о р м о л я р н о ii к о н н е н т р а п и е и 0.02 моль/дм-\ 1,4 г кристаллической лимонной кислоты. 0.8 i NaOH. 1.2 см³ концентрированно!! НС1 и 70.0 см³ этанола раство­ряют 13 воле и доводят объем до 1 дм-¹ (рН 4.1).

Р а з д е л я ю ш и ii б у ф е р н ы ii p a с т в о р м о л я р - ной к о н п е н т р а ц и е й 0.4 моль/дм-\ 84,0 г кристалличес­кой лимонной кислоты, 16,0 г NaOH и 4,0 см³ концентрирован­ной НС1 растворяют в воде и доводят объем до 1 дм³ (рН 3,5).

Раз д е л я ю щ и й буферный раствор для ос­новных и а р о ма т и ч е с к их а м и н о к и с л от мо­лярной концентрацией 0,3 моль/дм³. 24,6 г лимонной кислоты, 14 г NaOH и 6,5 см³ концентрированной НС1 растворяют в 1 дм³ Н₂0 (рН 5,23).

Разделяющий буферный раствор для об­наружения триптофана м о л я р н о й концен­трацией 1,5 моль/дм³. 7,0 г лимонной кислоты, 4,0 г NaOH. 81,9 NaCl, 100 см³ метилцеллозолыза растворяют в воде и доводят объем до 1 дм³ (рН 6,0).

К а д м и й-н и н г и д р и н о в ы й проявитель. Раствор А: 1 г перекристаллизованного нингидрина растворяют в смеси ацето­на (100 см³) и ледяной уксусной кислоты СН₃СООН (10 см³).

Раствор В: 1 г ацетата кадмия растворяют в 100 см³ раствора СН.СООН массовой долей 50 %.

Г^еред проявлением смешивают 100 см³ раствора А и 20 см³ раствора В.

Методические указания. При хроматографии аминокислот в тонком слое в качестве ионообменника обычно используют силь­нокислый сульфополистирольный катионит «Дауэкс 50 х 8» или близкие к нему типы смол в №⁺-форме. Подготовленную к работе смолу наносят тонким слоем на инертную подложку (тонкослой­ный вариант), а затем на поверхность слоя ионообменника на пластинке наносят анализируемую смесь аминокислот в буфер­ном растворе с низкой ионной силой и рН не выше 3,0, при кото­ром все протеиногенные аминокислоты заряжены положительно. При нанесении аминокислот в форме катионов они связываются с сульфополистиролом, замещая часть ионов натрия. Прочность удержания аминокислот на ионообменике зависит от их основ­ности: наиболее прочно связываются лизин, гистидин, аргинин, наименее прочно — аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Пос­ле нанесения смеси пропускают элюирующий буферный раствор через тонкий слой смолы. Для элюирования используют цитрат - ный буфер с более высокой ионной силой и рН выше 3,0. В этих условиях происходят постепенная нейтрализация положительного

124

заряда и ослабление конных взаимодспс nsini; кроме того. \велп ченпс концентрации ионов натрия в элюируюшем растворе также приводит к вытеснению катионов аминокислот из связей с ионо- обменнпком. Таким образом, в процессе ионообменной хромато­графии аминокислоты сразу же разделяются на три большие груп­пы: наиболее быстро через слои смолы движутся кислые амино­кислоты. затем нейтральные и наиболее медленно — основные По мере протекания через ионообменник элюирующего раствора происходит постепенное разделение нейтральных аминокислоте поскольку на прочность взаимодействия с катионитом оказыва­ют влияние не только ионные, но и гидрофобные взаимодей­ствия. Полистирольная (гидрофобная) матрица ионообменника достаточно избирательно взаимодействуете радикалами нейтраль­ных аминокислот, поэтому все они, несмотря на близость вели­чин заряда их молекул, разделяются в процессе хроматографии. Из всех нейтральных аминокислот наиболее прочно сорбируются на матрице те, которые содержат бензольные кольца, т. е. тирозин и фенилаланин. По окончании процесса хроматографии амино­кислоты выявляют с помощью нингидринового проявителя.

Для тонкослойной ионообменной хроматографии аминокислот используют пластинки «Фиксион 50 х 8» (Венгрия), в которых слой катионита «Дауэкс 50x8» толщиной 0.25 мм закреплен на пласт­массовой подложке. Хроматография на пластинках «Фиксион 50x8» позволяет сочетать принцип ионного обмена с преимуще­ствами тонкослойного варианта и отличается высокой чувствитель­ностью, быстротой разделения и простотой процедуры. Она неза­менима при сравнительных анализах белковых гидролизатов, ис­следовании свободных ами­нокислот, изучении первичной структуры пептидов.

Пластинки проявляют в темноте при комнатной темпе­ратуре или в термостатах при 105 °С в течение 10 мин.

На пластинках «Фиксион 50x8» при однократном про­пускании растворителя может быть разделено 14—16 амино­кислот, входящих в состав бел­ка (рис. 1.34, а). В случае недо­статочно хорошего разделения

Рис.1.34. Разделение стандартной смеси аминокислот на пластинках «Фиксион 50x8»:

а — одномерное; б — лимерное

Асп

Тре+сер Глу

Цис Гли Ала

(Про)

Вал

Mem

Иле Лей

Тир Фен

Гис Лиз Арг

I

а

с <и S Ii "" 'i? 'З- я; <J ^1,1 ~

б

125

смеси аминокислот одномерным способом прибегают к димер- ной хроматографии, пропуская тот же или другой растворитель в направлении, перпендикулярном предыдущему. На практике поступают следующим образом. В две точки стартовой линии хроматограммы помещают исследуемый раствор. После одно­кратного пропускания растворителя пластинку сушат, отрезают от нее часть, соответствующую крайней стартовой точке хрома­тограммы, и проявляют нингидрином. В случае плохого разде­ления оставшуюся большую часть пластинки поворачивают на 90° и снова помещают в тот же самый или другой растворитель. Проводят повторное хроматографирование во втором направле­нии. После высушивания пластинку также проявляют нингид­рином (рис. 1.34, б).

Для оценки количественного содержания аминокислот в ис­следуемом образце белка наряду с гидролизатом в отдельные точ­ки хроматограммы наносят растворы аминокислот — «свидете­лей». Стандартные растворы аминокислот наносят в несколько (4—6) точек хроматограммы из расчета 0,01—0.06 мкмоль в пятно, триптофан — до 0,1 мкмоль.

рН образца должен быть ниже 3,0 (обычно его доводят до 2,0). Часто образец наносят на пластинку в натрий-цитратном или фосфатно-цитратном буфере рН 2,2. Для этого гидролизат или экстракт белка (= 1 мг) растворяют в 1 см³ смеси, состоящей из двух частей этанола 96 об.% и 1 части фосфатно-цитратного бу­фера (рН 2,2).

Подготовка проб. Пробы мяса и мясопродуктов готовят в соот­ветствии с рекомендациями по подготовке проб, описанными в лабораторной работе № 15.

Для обнаружения триптофана предварительно проводят ще­лочной гидролиз белка. Гидролизат разбавляют водой и подкисля­ют концентрированной НС1 до рН 5,0.

Порядок проведения анализа. Ионообменную смолу пластинок перед употреблением уравновешивают соответствующим буфе­ром. Для этого пластинку накладывают обратной стороной на стекло того же размера. На верхний край пластинки с помощью

стеклянных палочек (или резинового коль-

ца) прикрепляют 4 слоя фильтровальной

t~J бумаги, сложенной так, чтобы короткая

S—_—~ —часть (1,5—2 см) прикрывала слой смолы,

а длинная была загнута на обратную сто­рону, т.е. к стеклу (рис. 1.35). Пластинку

Рис. 1.35. Уравновешивание пластинки «Фиксион 50 х 8» буферным раствором:

/ — пластинка; 2—стекло; 3 — фильтровальная бумага; 4— стеклянная палочка (или резиновое кольцо)

126

имеете ео стеклом помешают в камеру лля восходящей хромато­графии так. чтобы нижнип край пластинки был погружен в бу­ферный раствор на 1 — 1.5 см. Пластинка должна быть расположе­на в камере под углом к поверхности буфера.

Уравновешивание пластинок проводят в закрытой камере при комнатной температуре в течение 15—18 ч буферным раст­вором рН 3,28 молярной концентрацией 0,02 моль/дм³ следую­щего состава:

Все буферные растворы следует готовить на деионизирован- ной воде.

По окончании уравновешивания пластинки вынимают из ка­меры, снимают фильтровальную бумагу и сушат их на воздухе. Пластинки можно хранить неограниченно долгое время.

Для разделения аминокислот исследуемый образец наносят на пластинку капилляром (следует избегать повреждения слоя смолы) на стартовую линию, расположенную в 2—3 см от ниж­него края в виде пятна или полосы. В случае необходимости на пластинку наряду с опытной пробой наносят стандартные растворы аминокислот в том же буфере в количестве 0,01 — 0,03 мкмоль каждой аминокислоты на пятно. Пластинку с нане­сенным образцом помещают в хроматографическую камеру, на дно которой слоем 1 см наливают буферный натрий-цитратный раствор (рН 3,28).

Разделение аминокислот проводят в закрытой камере, насы­щенной парами растворителя, восходящим способом при темпе­ратуре 50 °С. После окончания хроматографии (60—90 мин) ра­створитель должен подняться по пластинке примерно на 18 см. Пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе и проявляют раствором нингидрина. Для проявления пластинку осторожно опрыскивают из пульверизатора раствором нингидрина в ацето­не массовой долей 0,1 %. Для получения стойкой окраски хрома­тограмму можно проявлять нингидриновым реактивом, содержа­щим кадмий.

Идентификацию аминокислот в исследуемых образцах прово­дят, руководствуясь порядком расположения на хроматограмме стандартных аминокислот. Порядок расположения аминокислот при одномерной хроматографии на пластинках «Фиксион 50 х 8» в направлении от старта к фронту: аргинин, лизин, гистидин, фе- нилаланин, тирозин, лейцин, изолейцин, метионин, валин, про- лин (пятно желтого цвета), аланин, глицин, цистеин, глутамино- вая кислота, треонин + серин, аспарагиновая кислота.

Лимонная кислота NaOH

HC1 (37/6-ная) Вода

1.4 I-

0.8 г 1.2 см³ До 1 дм³

127

Хрома I i и piiMMi,! зарисовывают. шмечля расположение всех выявленных аминокислот, и ви з\ально сравниваю i uupoansa : в; различных образцов мяса и мясопродуктов по содержанию ЛМИНОКИСЛО Г.

Для количественного определения аминокислот после прояв­ления нингплрином полосу хроматограммы. соответствующую каждой из аминокислот (в кислой среде растворителей лучше дру­гих разделяются пятна лизина, аргинина и валина), вырезают и сканируют на денситометре при 510 нм. Результаты сканирования оценивают либо по площадям полученных пиков, которые рас­считывают путем умножения высоты пика на его ширину на уров­не половины высоты, либо по массам пиков. Для этого пики пере­водят на кальку. Пики на кальке вырезают и взвешивают. Для оп­ределения количества аминокислот строят калибровочный график зависимости площади пика (или его массы) от содержания амино­кислоты (мкмоль) для стандартных растворов аминокислот.

Построение калибровочного графика. Для построения калибро­вочного графика используют стандартный раствор аминокислот, который готовят в соответствии с рекомендациями, приведенны­ми выше (см. лабораторную работу № 15).

Результаты экспериментов и расчетов сводят в таблицу. Само­стоятельно формулируют выводы и заключение по работе.

Наименование и харак­теристика образца

Перечень идентифициро­ван н ы\ а м и н о кислот

Солержан ие ам и н о кислоты в образце, мг/г

Лабораторная работа N° 18 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКСТРАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Цель работы. Освоить различные методы количественного оп­ределения некоторых специфических азотсодержащих экстрак­тивных веществ мышечной ткани убойных животных (гистидин- содержащих дипептидов — карнозина и ансерина).

Задачи. Получить безбелковый экстракт пептидов из мышечной ткани и определить количество гистидинсодержащих дипептидов на основе фотометрических и хроматографических методов.

Объекты исследования. Образцы мышечной ткани различных видов сельскохозяйственных животных и птицы.

Методические указания. Карнозин и ансерин хорошо раствори­мы в воде, осаждаются этанолом, обладают буферным действием, в растворе дают щелочную реакцию, оптически активны. Карно­зин дает цветную реакцию с диазореактивом.

Гистидинсодержащие дипептиды определяют в безбелковом мышечном экстракте по цветной реакции с нингидрином после

128

разделения их методом хроматографии на бумаге или ионообмен­ной хроматографии. Карнозин. кроме того, может быть определен непосредственно в безбелковом мышечном экстракте пли на бу­мажной хроматограмме по цветной реакции Паули с диазотиро- ванной сульфаниловой кислотой. Часто колориметрическому оп­ределению дипептидов предшествует выделение их из безбелково­го мышечного экстракта в виде ртутного осадка.

Метод характеризуется более высокой чувствительностью по сравнению с хроматографией на бумаге и может быть использован также для микроопределения дипептидов после их модификации с помощью флуоресцентной метки — 7-хлор-4-нитро-2-окси-1,3-ди- азолия (НБД-хлорида). НБД-хлорид ковалентно связывается с ами­ногруппами аминокислот и пептидов и образует производное жел­того цвета. Реакция протекает по следующей схеме:

NCb NO,

CI NH-R

Все вышеперечисленные методы применяются для анализа экстрактивных веществ и могут быть использованы самостоятель­но или в сочетании в зависимости от цели и технического оснаще­ния лаборатории.

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРНОЗИНА В БЕЗБЕЛКОВОМ ЭКСТРАКТЕ

ПО ДИАЗОРЕАКЦИИ

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор сульфаниловой кислоты; свежеприготовленный раствор NaN0₂ массовой долей 5 %; раствор диазотированной сульфаниловой кислоты; карбонат натрия безводный и его раствор массовой долей 10 %; карно­зин — стандартный раствор 0,5 мг/см³; пипетки; пробирки; стек­лянные стаканы.

Приготовление реактивов. Раствор сульфаниловой кислоты. 0,9 г сульфаниловой кислоты растворяют в 9 см³ концентрированной НС1 и доводят объем дистиллированной во­дой до 100 см³.

Раствор диазотированной сульфаниловой кис­лоты. В мерную колбу вместимостью 100 см³, стоящую во льду, помещают 6 см³ раствора сульфаниловой кислоты, при­ливают 6 см³ свежеприготовленного раствора NaN0₂ массовой до-

129

- icи 5 ^сс, перемешивают и оставляют на 5 мин. Прибавляю! при перемешивании еше 24 см-' раствора \а\() массовой долей 5 ^с( и через 5 мин доводя т объем водой до 100 см~\ Каждый раз тговя! с веж nil раствор (на льду хранится в 1ечение ч).

Подготовка проб. При определении пептидов по дпазореакппп предварительно готовят безбелковые экстракты.

Экстракты мышечной ткани освобождают от белков хлорной кислотой или этанолом. Во втором случае безбелковый мышеч­ный экстракт не содержит солей.

При осаждении хлорной кислотой навеску мышечной ткани массой 3—5 г освобождают от жира, соединительной ткани и измельчают ножницами на холоде. К кашице добавляют 5 объе­мов охлажденного раствора НС10₄ молярной концентрацией 0.5 моль/дм³, гомогенизируют и тщательно растирают в ступке. Суспензию центрифугируют в течение 20 мин, надосадочную жидкость собирают, осадок вновь суспензируют в 1 — 1,5 объе­ма хлорной кислоты. Промывные воды соединяют с центрифу- гатом. Хлорную кислоту удаляют в виде перхлората калия. По­лученный центрифугат упаривают на роторном испарителе при температуре 40—45 °С.

При осаждении белков этанолом навеску мышечной ткани мас­сой 2—3 г, измельченную ножницами на холоде, переносят в гомоге­низатор с 5 объемами охлажденного этанола 96 об.%; гомогенат сли­вают в центрифужный стакан, оставляют при комнатной температу­ре на 20 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 3000 с ^-1. Надосадочную жидкость сливают в колбу с узким горлом (при обработке 2—3 г мышц объем колбы 200 см³, при полу­чении экстракта из большой навески можно пользоваться делитель­ной воронкой), осадок трижды промывают 15 см³ раствора этанола 80об.%, сливая центрифугат в колбу. К спиртовому экстракту при­ливают хлороформ (так, чтобы верхняя граница жидкости была в уз­кой части колбы), встряхивают в течение 15 мин и оставляют для отстаивания. Когда четко обозначится граница между водным и спиртохлороформным слоями, водный слой отсасывают шприцем, а в колбу доливают воду (до прежнего уровня), встряхивают и остав­ляют дгтя расслаивания. Водный слой отсасывают и присоединяют к первому. Эту операцию повторяют еще два раза. Объединенный вод­ный раствор упаривают на роторном испарителе.

Порядок проведения анализа. Безбелковый экстракт после упа­ривания на роторном испарителе растворяют в 1—2 см³ воды. От­бирают различные объемы этого раствора, доводят водой до 2 см³, приливают 3 см³ диазореактива, тщательно перемешивают и ос­тавляют на 5 мин. Затем добавляют 3 см³ раствора карбоната нат­рия массовой долей 10%, перемешивают и через 10 мин колори- метрируют при длине волны 490 нм. Следует убедиться в том, что интенсивность образующейся окраски пропорциональна количе­ству исследуемого раствора, взятого для определения.

130

С одержииие кнрно iiiiiu is оовеклал исследовании выражают и мпкромо.тях и И! МП I пп'рамм-про]tei 1 тал на ! г ткани п определя­ют с помошыо калибровочного i рафика.

Построение калибровочного графика. Ioioh.mi l i ли тар i нып раствор. содержащий or 0.05 ло 0.5 мкмоль карнозина toi 10 ло 100 мк1) к пробе. Производят окрашивание по описанию соответ­ствующею меюда и снимаю! показания .же/пнкпип. Cipo>u / ра­фик функции I) ~ /(с). Lie с - - копнет рация карпозина.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИПЕПТИДОВ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

НА БУМАГЕ

Материалы, реактивы и оборудование. Фенол перегнанный, водонасышенный; кислота соляная концентрированная; ацетон: раствор нингидрина в ацетоне массовой долей 0,5 %: хроматогра- фическая бумага; стандартные растворы карнозина и ансерина молярной концентрацией 0.01 моль/дм³: смесь для элюирования (раствор NaHCCh молярной концентрацией 0,1 моль/дм³ смеши­вают с этанолом "в соотношении 1:1): диазотированная сульфа- ниловая кислота; растворы NbtCO. массовыми долями 20 и 1 %; стеклянные пипетки; воронки;" стаканы; пробирки; хроматогра­фические камеры.

Подготовка проб. При определении карнозина и ансерина ме­тодом хроматографии навеску мышечной ткани массой 3—5 г об­рабатывают точно так же, как это описано для определения сво­бодных аминокислот (см. лабораторную работу N° 15).

При исследовании карнозина непосредственно в безбелковом экстракте ткани или в случае осаждения дипептидов в виде ртутных солей этот метод несколько изменяют: водный экстракт после ста­дии осаждения упаривают не досуха, а до объема 1—2 см³.

Порядок проведения анализа. Дипептиды и составляющие их аминокислоты хорошо разделяются методом бумажной хромато­графии в водонасыщенном феноле или системе я-бутанол — про- панол —- раствор аммиака массовой долей 20 % в соотношении 2:2: 1. Хроматограмму обрабатывают раствором нингидрина или диазотированной сульфаниловой кислотой (для выявления карно­зина и гистидина).

На дно хроматографической камеры помешают кристаллизатор или чашку Петри с водонасышенным раствором фенола. Туда же ставят стаканчик со смесью концентрированной НС1 и воды в со­отношении 3:1, камеру закрывают и оставляют для насыщения парами растворителя.

Для проведения хроматографического разделения на листе хроматографической бумаги нужного размера на расстоянии 4 см от нижнего края проводят стартовую линию, на которую наносят исследуемый раствор, содержащий дипептиды. Безбелко-

131

выи экстракт ткани после упаривания на роторном испарите ле чаше всею раслвормкн в смеси НСООН — СНХООН — Н.О в соотношении 7:5: 13 пли в растворе изопропанола массовой долей 10 ^ct. чтобы 1 см ' раствора соответствовал 1.5 — 2 г ткани, после чего нанося! на хроматограмму небольшими порциями (0.01—0.03 см³), подсушивая бумагу теплым воздухом. На эту же хроматограмму наносят стандартные растворы карнозина и ансерина, содержащие по 0.03—0,05 мкмоль в пятне. Бумагу сшивают в виде цилиндра (следят, чтобы края не соприкаса­лись) и помещают в хроматографическую камеру в строго вер­тикальном положении. Когда фронт растворителя дойдет до верхнего края бумаги, хроматограмму вынимают и высушивают под тягой в течение 2—3 сут. Следы фенола на хроматограмме удаляют горячим ацетоном. Для этого сухую хроматограмму сворачивают трубочкой, перевязывают ниткой, помещают в ци­линдр, заливают ацетоном при температуре кипения и оставля­ют на 10—15 мин; промывание повторяют 2—3 раза, а затем вы­сушивают под тягой.

К 9 см³ раствора нингидрина в ацетоне массовой долей 0,5 % прибавляют 1 см-³ воды. Раствор наливают в ванночку и рав­номерно пропитывают им хроматограмму. Затем ее сушат под тягой и помещают в термостат при 110—120 °С на 5—10 мин. При этом пятна карнозина и ансерина приобретают серо-голу­бую окраску.

Количественное определение дипептидов можно проводить либо путем сопоставления интенсивности и размера проявлен­ных пятен опытной пробы с пятнами стандартных растворов (в случае их несоответствия определение повторяют, изме­няя соответственно количество взятых растворов), либо путем элюирования окрашенных пятен с последующим фотометричес­ким определением окраски элюатов аналогично количествен­ному определению аминокислот. В этом случае окрашенные пятна элюируют в темноте в течение 2—3 ч смесью раствора NaHC0₃ молярной концентрацией 0,1 моль/дм³ и этанола в со­отношении 1 : 1, а затем колориметрируют на фотоэлектроколо- риметре при длине волны 582 нм.

При проявлении на хроматограмме карнозина диазореакти- вом хроматограмму обрабатывают из пульверизатора диазотиро­ванной сульфаниловой кислотой, для чего слегка влажную хро­матограмму опрыскивают раствором Na₂C0₃ массовой долей 20 %. Пятна карнозина приобретают интенсивную оранжевую окраску, окрашенные пятна элюируют раствором карбоната нат­рия массовой долей 1 %, колориметрируют при длине волны 500 нм. Пользуясь калибровочными графиками, рассчитывают содержание дипептидов в исследуемой пробе.

132

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИПЕПТИДОВ С ПОМОЩЬЮ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА ПЛАСТИНКАХ «СИЛУФОЛ»

Материалы, реактивы и оборудование. Пластинки «Силу- фол»: пзопропанол: концентрированный NH₄OH; спиртовой раствор НБД-хлорида массовой долей 0,8 9с: насыщенный раствор CH₃COONa в этаноле: хроматографические камеры; раствор нин­гидрина массовой долей 1 %: спектрофотометр.

Подготовка проб. Подготовка колонки для бумажной хрома­тографии и пластинок «Силуфол» — см. лабораторные работы № 16, 17.

Порядок проведения анализа. Безбелковый экстракт ткани в количестве 5—Юмкл наносят на пластинки «Силуфол» на рас­стоянии 1,5—2 см от краев и 1,5 см между пятнами, а также нано­сят стандартные растворы дипептидов (5—10 нмоль/дм³). Про­водят восходящую хроматографию в системе изопропанол — ам­миак — вода (7:2: 1). Камеру предварительно насыщают парами растворителя. Пластинки сушат под тягой. Пятна дипептидов выявляют, опрыскивая пластинку раствором нингидрина. Затем пластинки сушат в струе теплого воздуха и выдерживают при 70 °С в течение 10 мин. Пятна аминокислот проявляются при комнатной температуре, пятна дипептидов — при нагревании. Окраску сканируют.

Для получения НБД-производных дипептидов к 0,23 см³ спир­тового экстракта ткани добавляют 0,05 см³ смеси НБД-хлорида и насыщенного раствора CH₃COONa в соотношении 4:1. Пробу инкубируют в течение 20 мин при 75 °С, охлаждают и наносят аликвоты (4—Юмкл) на пластинку «Силуфол». Хроматографию проводят в системе изопропанол — вода (7 : 2). Сканируют при длине волны 470 нм, сравнивая показания с растворами с извест­ным содержанием пептидов.

Содержание специфических дипептидов (карнозина, ансерина) в мышечной ткани выражают в микромолях и (или) в милли- грамм-процентах на влажную массу ткани.

Полученные экспериментальные и расчетные данные оформ­ляют в виде таблицы.

Наименование и харак­теристика образца

Содержание дипептидов в образце

мкмоль/дм''

1

.J.

МГ;е

После обобщения экспериментальных данных самостоятельно делают выводы и заключение по работе.

133

Лабораторная работа N° 19

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНЫХ ЛИПИДОВ

В ЖИВОТНЫХ ТКАНЯХ

Цель работы. Освоить методы количественною определения суммарных липидов в животных тканях.

Задачи. Провести экстракцию липидпой фракции в аппарате Сокслета и определить массовую долю суммарных липидов грави­метрически и (или) колориметрически.

Объекты исследования. Мясо различных видов убойных живот­ных аналогичных анатомических участков или одного животного от разных отрубов мясной туши, субпродукты I и II категорий, яичный желток, жировые ткани.

Материалы, реактивы и оборудование. Петролейный или диэти- ловый эфир; смесь хлороформа, метанола и воды (2:1: 8); безвод­ный бензол; хлороформ; концентрированная серная кислота; про­каленный песок; фильтровальная бумага; водяная баня; термометр; часовое стекло; аппарат Сокслета; сушильный шкаф; бюксы; пле­ночный испаритель, колбы; аналитические весы; магнитная ме­шалка; центрифуга лабораторная; фосфованилиновый реактив.

Приготовление реактивов. Фосфованилиновый ре­актив. 400 мг ванилина, перекристаллизованного из хлорофор­ма или этанола, растворяют в 40 см³ воды и доводят объем до 200 см³ раствором Н₃Р0₄ массовой долей 85 %. Получают раствор ванилина молярной концентрацией 0,013 моль/дм³ в растворе фосфорной кислоты молярной концентрацией 11,8 моль/дм³. Реактив можно длительно хранить в темной склянке при ком­натной температуре.

Методические указания. Большинство липидов легко окисля­ются вследствие наличия в их структуре двойных связей, поэтому для их экстракции следует применять более чистые органические растворители, не содержащие следов окислителей. Склянки с растворителями хранят в металлических шкафах, вдали от нагре­вательных приборов, в темноте.

Для экстракции и хранения растворов липидов используют по­суду из темного стекла. Колбы, делительные воронки и другую посуду при работе с липидами закрывают только пришлифован­ными стеклянными пробками.

Для экстракции липидов применяют смесь из двух-трех раство­рителей. Суммарные липиды извлекают чаще всего смесью хлоро­форма и метанола в объемных соотношениях 2 : 1, 1 : 1 и 1 : 2 или этанола и диэтилового эфира 3:1, 1:1. Наиболее распространен­ным способом является метод Фолча — экстракция смесью хлоро­форма и метанола (2: 1), позволяющий извлекать 90—95 % всех клеточных липидов. Преимуществом метода Фолча является то, что используемая смесь растворителей не проявляет селективнос­ти по отношению к тем или иным группам липидов.

134

Piic. 1.36. Аппарат Сокслета:

/—приемная колба; 2 — |руСжа лля ! юс i \ плення парон расжортсля m колбы и 'jKcipaKiop. - холодильник. 4 — .жарактор: 5 -- сифоннлл грубка. 6—Гпмажпая гплтол с навеской исслел>емого материал;!

Для определения массовой доли суммарных ли­пидов предварительно обезвоженный образец ткани экстрагируют петролейным эфиром, диэтиловым эфиром или смесью эфира и этанола. Полное извле­чение липидов из тканей достигается путем много­кратной экстракции летучим растворителем в аппа­рате Сокслета (рис. 1.36). Все части аппарата плотно соединяют между собой при помощи шлифов. Пары эфира из экстракционной колбы при нагревании поднимаются по трубке экстрактора и попадают в холодильник. Здесь они охлаждаются, сгущаются и каплями стекают в экстрактор, где в бумажной гиль­зе находится исследуемый материал. Гильза посте­пенно наполняется эфиром, который экстрагирует жир из ткани. Когда уровень эфира поднимется выше верхнего колена сифонной трубки, эфир вмес­те с растворенным в нем жиром стечет в нижнюю часть аппа­рата — экстракционную колбочку. Жир остается в колбочке, а пары эфира вновь поднимаются и экстрагируют новую порцию жира. Исследуемое вещество, подвергаясь многократной по­вторной экстракции, полностью обезжиривается. Жир переме­щается в колбочку.

Массовую долю экстрагированных липидов определяют грави­метрически или колориметрически.

1. ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД В АППАРАТЕ СОКСЛЕТА

Подготовка проб. Образец мяса тщательно измельчают ножом на часовом стекле, взвешивают навеску массой (3,0000 ± 0,0002) г и помещают в тарированный бюкс с прокаленным до постоянной массы песком.

Стеклянной палочкой перетирают мясо с песком и высушива­ют в сушильном шкафу при 100—105 °С до постоянной массы. Вычисляют массовую долю влаги в исследуемом образце. Сухой остаток используют для определения суммарных липидов.

Порядок проведения анализа. Сухую пробу количественно пере­носят в предварительно взвешенную гильзу из фильтровальной бумаги, гильзу повторно взвешивают и помещают в экстрактор аппарата Сокслета.

В экстракционную колбу аппарата наливают эфир и соединя­ют все части прибора. Прибор помещают на водяную баню. Холо-

135

J jl^;! ьн и к соединяют с водопроводным краном, включают ВОДУ и нагревают баню до 45—50 °С. Ориентировочная продолжитель­ное гь же гpaI ирования 4—6 ч. Коней экстрагирования определя­ют. поднося к экстрактору часовое стекло, куда стекает немного эфира. Экстрагирование считается законченным, если после ис­парения эфира на стекле не остается налета жира.

По окончании экстрагирования гильзу вынимают из экстрак­тора, высушивают до постоянной массы и вычисляют массовую долю липидов в исходной навеске по формуле

= 100 (/H₃-W₄)/(_WI-/W₀), (1.25)

где т_% — масса гильзы с навеской до обезжиривания, г; т_А -- масса гильзы с навес­кой после обезжиривания, г; /?7, — .масса бюкса с песком и навеской до высушива­ния. г; /»₀ — масса бюкса с песком, г.

• Массовую долю липидов (% к массе абсолютно сухого веще­ства) определяют по формуле

100(/я₃-/я₄)/(/и₃-/и₅), (1.26)

где т₅ — масса гильзы, г.

2. ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД В ПЛЕНОЧНОМ ИСПАРИТЕЛЕ

Подготовка проб. Навеску массой 100 г очищенной от жира и пленок сердечной мышцы или печени измельчают при темпера­туре 2—4 °С и гомогенизируют в органическом растворителе с частотой вращения 116,6—133,3 с^-1 при комнатной температуре 1—2 мин. Гомогенат переносят в колбу с притертой пробкой и за­ливают тремя объемами смеси хлороформ — метанол в соотноше­нии 2:1. Экстракцию липидов проводят при комнатной темпера­туре при постоянном перемешивании с помощью механической или магнитной мешалки в течение 30 мин.

Суспензию центрифугируют с частотой вращения 33,3 м^-1 в те­чение 15—20 мин, органическую фазу отделяют, а остаток перено­сят в прежнюю колбу и повторяют экстракцию еще 2 раза в тех же условиях. Объединенные экстракты упаривают в вакууме, остаток липидов растворяют в 5—10 см³ смеси хлороформ — метанол— вода (6:3: 0,45).

Для удаления нелипидных примесей используют сефадекс G-25, который предварительно освобождают от мелких частиц и высушивают, суспендируют в трех объемах смеси хлоро­форм — метанол —- вода (6 : 3 : 0,45) и оставляют набухать в тече­ние 10—12 ч. Набухшим сефадексом заполняют колонку размером 2x15 см, на дно которой предварительно помещают промытую

136

стекловату. После заполнения на поверхность сефадекса также кладут стекловату и готовую колонку промывают одним объе­мом смеси. Для очистки на колонку наносят экстракт липидов (20—30 %) и элюируют их 1,5—2 объемами той же смеси. В элю- ате содержатся практически все липиды, нелипидные примеси остаются на колонке и могут быть смыты с нее смесью хлоро­форм — метанол (1 : 1).

Очищенный от нелипидных примесей экстракт переносят в колбу пленочного испарителя, растворитель отгоняют, к остат­ку добавляют 10 см³ безводного бензола, тщательно перемеши­вают и отгоняют бензол. Липиды, освобожденные от следов воды, растворяют в небольшом объеме свежеперегнанного бен­зола, переносят в пробирку с притертой пробкой и хранят в темноте на холоде.

Порядок проведения анализа. Круглодонную колбу для пленоч­ного испарителя доводят до постоянной массы, помещают в нее отмеренный объем липидного экстракта, содержащий 10—20 мг липидов, и растворитель упаривают в токе азота или в пленочном испарителе. Колбу с осадком липидов доводят до постоянной мас­сы в вакуум-эксикаторе над КОН. Сухую массу липидов рассчи­тывают по разности постоянной массы колбы с осадком и пустой колбы. Взвешивание проводят на аналитических весах.

3. КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД

Подготовка проб. К одному яичному желтку добавляют 50 см³ смеси хлороформа, метанола и воды (2:1: 0,8) и экстрагируют при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки в течение 30 мин. Центрифугируют 20 мин с частотой вращения 33,3 с^-1 и отделяют органическую фазу, содержащую липиды. Ос­таток заливают новой порцией растворителя и операцию повторя­ют еще несколько раз. Липидные фракции объединяют.

Для освобождения от нелипидных примесей экстракт пере­носят в делительную воронку, добавляют 20 % воды от его объе­ма, перемешивают и после разделения водной и органичес­кой фаз последнюю переносят в колбу пленочного испарителя и отгоняют растворитель в вакууме. Для высушивания к остат­ку добавляют 5—7 см³ безводного бензола, перемешивают и от­гоняют бензол, процедуру повторяют несколько раз. Осадок ли­пидов растворяют в точном объеме (5—10 см³) свежеперегнан­ного хлороформа, переносят в пробирку с притертой пробкой и хранят в темноте на холоде.

Порядок проведения анализа. В пробирку с пришлифованной пробкой помещают 50 нм³ липидного экстракта (для контроля в пробирку берут 50 нм³ хлороформа) и испаряют на водяной бане. Добавляют 0,2 см³ концентрированной H₂S0₄ и нагревают на во-

137

.4 я ной бане при темнершуре кипения в течение И) мин. Про­бирки охлаждают, добавляют в них по 2.5 ем-' фосфованпдино- вого реактива, перемешивают и выдерживают при 37 °С в тече­ние 15 мин: колориметрируют против контроля при длине вод­ны 540 нм. Содержание липидов рассчитывают по калибровоч­ному графику.

Построение калибровочного графика. В качестве стандартного используют раствор высокоочишенного абрикосового или олив­кового масла в хлороформе. Берут аликвотное количество стан­дартного раствора и готовят разведение в соответствии с чувстви­тельностью метода от 10 до 120 мкг. Затем проводят качественную реакцию согласно описанию метода и колориметрируют при дли­не волны 540 нм против контроля. После снятия показаний опти­ческой плотности для всех концентраций строят график D = f[c), где с — концентрация липидов.

Студенты выполняют расчеты в соответствии с эксперимен­тальными данными. Результаты оформляют в виде таблицы.

Наименование и источник образна	Массовая доля суммарных липидов
	% к массе образна	% к массе абсолютно сухого вещества

Экспериментальные данные сравнивают с литературными и полученными разными методами, самостоятельно делают выводы и формулируют заключение.

Лабораторная работа Ns 20 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА ЖИРОВ

Цель работы. Установить состав и массовую долю фракций животных жиров на основе их способности к кристаллизации и плавлению.

Задачи. Выделить низко-, средне- и высокотемпературные фракции пищевых топленых жиров разных видов и сортов; опре­делить температуры плавления фракций жира и рассчитать их массовые доли.

Объекты исследования. Пищевые животные жиры разных ви­дов и сортов.

Материалы, реактивы и оборудование. Капилляр, открытый с двух концов' термометр; штатив с кольцом; стакан вмести­мостью 500 см , мешалка; вакуум-насос; колба Бунзена; термо­стат; весы аналитические; прибор для определения температу­ры плавления.

138

Методические указания. При медленном охд„жлении жиры способны кристаллизования. Это снопе i во лежт. например, в основе получения маргарина. Тршлицериды жирных кислот в расплавленном состоянии не имеют иве!а. вкуса и запаха. На способности различных жировых фракций плавиться, кристал­лизоваться при определенной температуре основан метод твх разделения.

Пониженная усвояемость и высокая температура плавления ограничивают применение говяжьего и бараньего жиров в ка­честве пищевых продуктов. Значительная часть этих жиров ис­пользуется на технические цели. Повышения потребительских свойств говяжьего и бараньего жиров можно достигнуть за счет разделения их на фракции, содержащие различные по темпера­туре плавления триглицериды.

Переход в капельно-жидкое состояние совершается не мгно­венно, а в пределах некоторого интервала температур, в котором плавятся отдельные компоненты смеси. У насыщенных жирных кислот температура плавления возрастает с увеличением молеку­лярной массы. У ненасыщенных жирных кислот на температуру плавления влияют не столько двойные связи, сколько их положе­ние в цепи и пространственное расположение отдельных частей молекулы. Определенное влияние на изменение температуры плавления оказывает полиморфизм.

Методы определения температуры плавления заключаются в постепенном нагревании твердого жира до момента расплавления, который характеризуется по прозрачности, подвижности, освет- ленности и т. п. На практике температура плавления устанавлива­ется по температуре, при которой жир становится подвижным.

Существует два метода определения температуры плавления: по сползанию капли жира в капилляре с расширением и по под­нятию жира в открытом капилляре.

При разделении жировых фракций на основе кристаллизации используют различные подходы.

Классический метод проведения процесса фракционирования животных жиров заключается в медленном охлаждении расплавлен­ного жира, в результате чего из говяжьего и бараньего жиров получа­ют легкоплавкую фракцию — олеомаргарин или олеоойл, из свино­го — лярд-ойл, а также твердую фракцию — олеостеарин.

Олеомаргарин имеет цвет от светло-желтого до желтого, при­ятный вкус, напоминающий сливочное масло, его можно ис­пользовать в домашних условиях, для производства высокока­чественной маргариновой продукции, в хлебопечении. Костный жир, полученный из цевок крупного рогатого скота, фракциони­руют с целью выделения легкоплавкой фракции для производства смазочных масел, не замерзающих при низкой температуре.

Обнаружение и расчет массы фракций весьма полезны при оценке биологической ценности жиров.

139

Подготовка проб. Образцы пищевых топленых жиров мае сой по 35—40 г помещают в предварительно высушенные и взвешенные пробирки и нагревают в камере ультратермостата UTU-2. защищенной от естественного света, до температуры 65—70 °С. Первую стадию кристаллизации проводят при темпе­ратуре 40—45 °С в течение 24 ч для наиболее полного разделения твердой и жидкой фракций. Для обеспечения равномерной крис­таллизации содержимое пробирок рекомендуется периодически плавно перемешивать.

1. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ПИЩЕВЫХ ТОПЛЕНЫХ ЖИРОВ КРИСТАЛЛИЗАЦИЕЙ

Порядок проведения анализа. Оставшуюся жидкой при тем­пературе 40—45 °С жировую фракцию отфильтровывают вакуум- насосом в колбу Бунзена, помещают в высушенную и взвешен­ную пробирку и термостатируют далее, снизив температуру в тер­мостате на 10 °С.

Операции по разделению фракций жира повторяют, ступенча­то проводя снижение температуры до 20—22 °С. Продолжитель­ность каждой стадии кристаллизации 30—40 мин.

Выход каждой фракции жира определяют гравиметрически. Массовый выход фракций жира (%) определяют по формуле

М= \(т₂-т_ъ)/т_х\т, (1.27)

где т₂ — масса пробирки с соответствующей фракцией жира, г; т^ — масса пустой пробирки, г; /и, — масса исходной пробы жира, взятой на фракционирование, г; 100 — коэффициент для перевода в проценты.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ПЛАВЛЕНИЯ ФРАКЦИЙ

Порядок проведения анализа. Пробу исследуемой фракции жира, полученной по п. 1, нагревают в пробирке на водяной бане до полного расплавления. Чистую сухую, открытую с двух кон­цов капиллярную трубочку из тонкого стекла с внутренним ди­аметром 1,0—1,2 мм (длина капилляра 50—60 мм) погружают од­ним концом в расплавленный жир так, чтобы высота его в ка­пилляре была равна 10 мм. Затем капилляр с жиром выдержива­ют на льду в течение 10 мин.

После этого капилляр прикрепляют к термометру с ценой деле­ния шкалы 0,1 °С тонким резиновым кольцом так, чтобы столбик жира находился на одном уровне с ртутным шариком термометра. Термометр с капилляром опускают в стакан с дистиллированной водой на глубину 3—4 см. Начальная температура воды в стакане должна быть 15—18 °С. Следят, чтобы в незаполненный конец ка-

140

Рис. 1.37. Установка для определения температуры плавления в открытом с двух концов капилляре:

/ — механическая или магнитная мешалка; 2 — термометр: 3 — капилляр

пилляра не попала вода. При непрерывном пере- мешивании магнитной мешалкой воду в стакане нагревают сначала со скоростью приблизительно 2°С/мин, а но мере приближения к ожидаемой температуре плавления — не более чем 1 °С/мин. Общий вид установки показан на рис. 1.37.

В качестве температуры плавления фиксируют ту, при которой жир в капилляре начинает под­ниматься. Эксперимент повторяют не менее двух раз, за результат принимают среднее арифмети­ческое двух параллельных опытов, результаты которых должны отличаться не более чем на 0,5 °С.

Результаты экспериментов оформляют в виде таблицы.

Вил жира	Число фракций	Выход фрак­ции, %	Температура, °С
			плавления фрак­ции	кристаллизации

Затем самостоятельно анализируют полученные результаты, формулируют выводы и заключение по работе.

Лабораторная работа № 21 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ

Цель работы. Освоение методов выделения и фракционирова­ния фосфолипидов на примере яичного желтка.

Задачи. Провести качественную реакцию на лецитин; освоить методы фракционного осаждения и хроматографического разделе­ния фосфолипидов; охарактеризовать фосфолипидную фракцию анализируемого материала.

Объект исследования. Яичный желток.

Материалы, реактивы и оборудование. Фильтровальная бумага; химические стаканы; пробирки; капельницы; воронки; водяная баня; пипетки; этанол; ацетон; метанол; хлороформ; петролейный эфир; н-6утанол; фосфорномолибденовая кислота; ледяная ук­сусная кислота; нингидрин; А1₂0₃; хроматографическая колонка; тонкослойная пластина.

141

Меч одические указания. В v pv пв м жп.ю. и». ■ и.ирач /КНТСЯ 99- -9V.5 ' ( Ipiii липсри Юн О.. '.: н luni -Ml!: мри.М- • »"< фосфатиды (фосфо.'ппшлы ) с обще:: :;юр\:у, а-

(

1! " (.' R

I " ⁽⁾

I *

(11 л, ( к

I он

I /

<11 •:> V о \

О В

где ()=С—R[ и О—С—R-, — остатки радикалов жирных кислот (динодсвой. дино- леновой, пальмитиновой, стеариновой и т.д.); В — остаток азотистого основания или аминокислоты серина.

Методы их определения основаны на специфичности физико- химических свойств.

Работа состоит из двух этапов, каждый из которых рекоменду­ется изучить и освоить практически.

1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ЛЕЦИТИН

Подготовка проб. Для осуществления качественной реакции на лецитин яичный желток выпаривают досуха на водяной бане при температуре кипения. Сухой остаток используют для анализа.

Порядок проведения анализа. В химический стакан вносят 200—300 мг высушенного и растертого яичного желтка, прибавля­ют 15 см³ горячего этанола и все перемешивают. Через 10—15 мин смесь охлаждают и фильтруют в сухую пробирку. В другую сухую пробирку наливают 2—3 см³ ацетона и по каплям добавляют полу­ченный фильтрат. Наблюдают появление мути, а затем выпадение осадка лецитина, что указывает на нерастворимость лецитина в ацетоне. Если в пробирку к 2—3 см³ фильтрата прибавлять по кап­лям дистиллированную воду, то образуется стойкая эмульсия, что позволяет выделить лецитин из смеси липидов.

2. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ

Подготовка проб. Для хроматографического анализа фосфоли­пидов яичные желтки тщательно отделяют от белка, добавляют 400 см³ ацетона и смесь гомогенизируют в течение 10 мин. Гомо- генат оставляют в холоде на ночь. Осадок отделяют центрифуги­

142

рованием с частотой вращения 50 с 'в течение 20 мин. суспенди­руют в 400 см' ацетона и снова отделяют ценiрифугировани- ем. Обработку ацетоном повторяют. Затем осадок наносят тонким слоем на фильтровальную бумагу и сушат до исчезновения запаха ацетона в течение 1—2 ч.

Высушенный порошок заливают 200 см³ смеси хлороформ —■ метанол (1:1). Экстрагирование фосфолипидов проводят в те­чение 30 мин на вибровстряхивателе. Раствор центрифугируют с частотой вращения 50 с"¹ в течение 20 мин. Центрифугат от­деляют и сохраняют. Обработку осадка повторяют. Если цен­трифугирование не дает полного просветления надосадочной жидкости, проводят фильтрование на воронке Бюхнера. Цен- трифугаты (фильтраты) объединяют и выпаривают на роторном испарителе.

После выпаривания смесь фосфолипидов растворяют в 50 см³ петролейного эфира и добавляют 20-кратный объем (1000 см³) ацетона. Перемешивают и оставляют на ночь. Затем осадок от­фильтровывают на воронке Бюхнера, растворяют в 50 см³ пет­ролейного эфира и вновь повторяют осаждение. Растворы в пет- ролейном эфире обычно бывают мутными. После повторного осаждения и фильтрования осадок промывают 200 см³ ацетона прямо на фильтре.

2.1. РАЗДЕЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ НА КОЛОНКЕ С Al₂0₃

Порядок проведения анализа. Колонку диаметром 2,5 см и высотой не менее 50 см заполняют за 1—2 сут до разделения фосфолипидов. На дно помещают плотный слой стекловаты толщиной 1 см, затем наливают суспензию, состоящую из 170— 190 г А1₂0₂ в смеси с метанолом и хлороформом (1 : 1). При заполнении следует слегка постукивать по колонке деревян­ной палочкой для оседания и получения равномерного слоя адсорбента.

Сверху можно положить бумажный фильтр.

Полученную смесь фосфолипидов (10—15 г) растворяют в сме­си метанол — хлороформ (1 : 1) и наносят на колонку. Фосфати­дилхолин с примесью лизофосфатидилхолина и сфингомиелина вымывается 500 см³ смеси метанол — хлороформ (1 : 1). Первые 150 см³ и последние 100 см³ отбрасывают. После выхода фосфа- тидилхолина колонку промывают 100 см³ той же смеси. Фосфа- тидилэтаноламин с примесью фосфатидилсерина отмывается 50 см³ смеси этанол — хлороформ — вода (5:2: 2). Первые 200 см³ от­брасывают. Оба элюата упаривают на роторном испарителе досуха и получают приблизительно 5 г лецитина (фосфатидилхолина) и 2,5 г кефалина (фосфатидилэтаноламина).

143

2.2 АНАЛИЗ ФОСФОЛИПИДОВ С ПОМОЩЬЮ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Порядок проведения анализа. Для тонкослойной хроматографии применяют пластинки «Силуфол» (150 x 150 мм) и стандартные камеры. В качестве растворителя используют смесь хлороформ — метанол — вода в соотношении 65 : 25 : 4.

На две пластинки на расстоянии 1,5 см от их узкого края микропипеткой наносят хлороформные растворы фракций фос- фатидилхолина (в одно пятно) и фосфатидилэтаноламина (в другое пятно) в количестве 1—5 мкмоль. Пластинки помещают в камеру (предварительно за 2—3 ч для насыщения камеры в нее помещают растворитель). После разделения одну пластинку проявляют спиртовым раствором фосфорномолибденовой кис­лоты массовой долей 5 % (с фосфатидилхолином образуются синие пятна на желтом фоне), другую — раствором нингидрина на н-бутаноле массовой долей 0,3 %, содержащем уксусную кислоту массовой долей 3 %. Все фосфолипиды, содержащие NH₂-rpynny (фосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилэтанола- мин, фосфатидилсерин), проявляются в виде розовых пятен на сером фоне.

Студенты фиксируют в тетради условия и эффект, полу­ченный от реакций, включая качественную реакцию на ле­цитин и разделение фосфолипидов, анализируют эксперимен­тальные данные, формулируют выводы и составляют отчет о работе.

Лабораторная работа Ns 22 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА

Цель работы. Приобрести практический навык определения холестерина в мясопродуктах (мозг, шпик, колбасные изде­лия и т. д.).

Задачи. Провести подготовку к анализу; получить и исследо­вать кристаллы холестерина; определить содержание холестери­на в объектах исследования.

Объекты исследования. Ткань головного мозга, желчь, яичный желток, сыворотка или плазма крови убойных животных.

Методические указания. Холестерин нерастворим в воде, раз­бавленных кислотах и щелочах, но растворим в жирах и их раство­рителях: эфире, хлороформе и бензоле. Холестерин кристаллизу­ется из этанола в виде пластинок с перламутровым блеском, жир­ных на ощупь. Кристаллы содержат одну молекулу воды, имеют

144

температуру плавления 147 С и о i носятся к числ\ наиболее тер­мос гаоильных органических вешесж. lit .>фира. хлороформа и бензола холестерин кристаллизуется в миле безводных топких игл с шелковистым блеском. Растворы холестерина в хлороформе и эфире оптически активны, [о.]¹^ = -31,59.

В то время как эфиры холестерина не абсорбируют воду, свободный холестерин может поглотить се массу, в 500 раз превышающую собственную. Высокая массовая доля воды в мозге связана с высокой массовой долей холестерина в этом органе.

Холестерин является хорошим изолятором электрического то­ка. Уменьшение содержания холестерина в организме ниже фи­зиологической нормы приводит к анестезии и ряду нервных и психических расстройств. Он является фактором воспроизводства, увеличивающим плодовитость животных, обладает способностью связывать яды и токсины, в связи с чем играет важную роль в фор­мировании иммунитета; предупреждает гемолиз эритроцитов, вы­зываемый лецитином.

Вместе с тем химическая стойкость холестерина и практически полная нерастворимость в тканевых жидкостях приводят с возрас­том к аккумулированию его в организме, что является фактором риска ряда заболеваний, в связи с этим требуется контроль его уровня в продуктах питания и пищевых рационах.

Для обнаружения холестерина применяется ряд качествен­ных цветных реакций, химизм которых связан с переводом его из вторичного спирта в непредельный углеводород путем дегид­ратирования.

Для получения растворов холестерина в хлороформе к сухим остаткам холестерина, выделенного из образцов нервной ткани и желчи на этапе подготовки пробы, добавляют обезвоженный хлороформ из расчета получения раствора холестерина с массо­вой долей 0,3 %.

При действии концентрированной серной кислоты стеролы дегидратируются и окисляются с образованием смеси сложных продуктов.

Раствор холестерола в хлороформе дает с уксусным ангид­ридом и концентрированной серной кислотой красное окра­шивание, переходящее затем в синее и зеленое. Таким обра­зом, при наличии серной кислоты происходят дегидратация и окисление холестерола. В результате две молекулы холесте­рола, потерявшие две молекулы воды, соединяются между со­бой по третьему атому углерода. Образовавшиеся непредель­ные углеводороды с сопряженными двойными связями дают различные производные с серной кислотой и уксусным ан-

145

I и. i p и. i о \ 1 001 таено схеме

H H

t

H < H

■Ha)

После обработки хлороформенното раствора холестерола рав­ным объемом серной кислоты массовой долей 92 % он окрашива­ется в кроваво-красный цвет, переходящий затем в пурпурный. Отстоявшийся слой серной кислоты приобретает слабо-зеленую флуоресценцию. Чувствительность реакции 0,001 мас.%.

В результате дегидратации холестерина реакция с уксусным ангидридом и концентрированной серной кислотой приводит к образованию окрашенной в зеленый цвет сульфокислоты — хо- лестерилена.

Смесь раствора холестерина в хлороформе с уксусным ан­гидридом и концентрированной серной кислотой окрашива­ется в быстро исчезающий красный цвет, затем в синий и, наконец, в более стойкий зеленый цвет. При незначитель­ной массовой доле холестерина в растворе сразу образуется зеленое окрашивание.

146

Эта цветная реакция служит и для количественного определе­ния холестерина в крови или сыворотке крови.

При проведении лабораторного практикума рекомендуется ознакомиться и освоить все рекомендуемые методы определения холестерина.

1. ПОЛУЧЕНИЕ КРИСТАЛЛОВ ХОЛЕСТЕРИНА

Материалы, реактивы и оборудование. Гипс; этанол 96%-ный; эфир; фарфоровая ступка; стеклянная пластинка размером 10 х х 10 см, сушильный шкаф; термометр; микроскоп; предметное стекло; пипетка.

Подготовка проб. При анализе тканей тщательно растирают 3—5 г ткани в фарфоровой ступке с 6—Юг гипса до гомогенной массы, которую распределяют стеклянной палочкой или скальпе­лем тонким слоем по стеклянной пластинке и высушивают в су­шильном шкафу при 60 °С.

Порядок проведения анализа. К сухому остатку неочищенного холестерина добавляют спиртоэфирную смесь (соотношение спир­та и эфира 1 : 2 по объему) из расчета получения раствора массо­вой долей холестерина 2 %.

На предметное стекло наносят пипеткой 1—2 капли эфир­но-спиртового раствора холестерина и испаряют до выпадения кристаллов.

147

в виде зарисовок с ния. Пример показан на рис.

Piu i.3<S Крипа мы чоиччерина (8x40)

Кристаллы холестерина мпкроскопиру- ют, используя объектив с увеличением х 40. Операции выполняют с холестерином, взя­тым из нервной ткани различных видов жи­вотных. Результаты наблюдений оформляют указанием объекта и применяемого увеличе- .38.

2. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА ХОЛЕСТЕРИН

Материалы, реактивы и оборудование. Концентрированная сер­ная кислота; раствор серной кислоты массовой долей 92 % (плот­ность 1,76 г/см³); формалин; уксусный ангидрид; безводный хло­роформ; пробирки с притертыми пробками; штатив.

Подготовка проб. Высушенную мозговую ткань с гипсом в со­ответствии с методикой подготовки проб (см. п. 1) соскабливают скальпелем со стекла и измельчают в ступке. К сухому порошку в пробирке добавляют 5—6 см³ хлороформа и экстрагируют в тече­ние 5—10 мин. Для лучшей экстракции содержимое пробирки периодически встряхивают. Полученный экстракт в хлороформе фильтруют в сухую пробирку и используют для проведения ка­чественных реакций на холестерол.

При использовании в качестве объекта исследования желчи пробу объемом 20 см³ выпаривают досуха на водяной бане при температуре кипения. К сухому остатку добавляют 5—10 см³ эфи­ра, тщательно перемешивая стеклянной палочкой. Эфирный экс­тракт фильтруют, испаряют досуха и используют для проведения качественных реакций на холестерин.

При анализе яичного желтка его выпаривают досуха на водя­ной бане при температуре кипения. Для получения хлороформен- ного экстракта к 1 г сухого остатка добавляют 5—6 см³ хлороформа и экстрагируют в течение 5—10 мин. Для лучшей экстракции со­держимое пробирки периодически встряхивают. Полученный эк­стракт в хлороформе фильтруют в сухую пробирку и используют для проведения качественных реакций.

2.1. РЕАКЦИЯ С СЕРНОЙ КИСЛОТОЙ (РЕАКЦИЯ ЗАЛКОВСКОГО)

Порядок проведения анализа. В 2 пробирки с притертыми проб­ками вносят по 2 см³ полученного из разных источников раствора холестерина в хлороформе массовой долей 0,3 %, добавляют по

148

2см-¹ раствора серпок кислоты массовок .имей ")2 (пдонкклью 1,76 г/см-¹) п вс гряхп ваюi.

После разделения слоев хлороформа к серной кислоты фикси­руют изменение окраски.

2.2. РЕАКЦИЯ СО СМЕСЬЮ ФОРМАЛИНА И КОНЦЕНТРИРОВАННОЙ СЕРНОЙ КИСЛОТЫ

Порядок проведения анализа. В пробирку с притертой проб­кой помещают 2 см³ раствора холестерина в хлороформе массо­вой долей 0,3 %, добавляют 2 см³ смеси концентрированной серной кислоты с формалином (на 50 г концентрированной серной кислоты 1 г формалина) и встряхивают. После раз­деления слоев хлороформа и серной кислоты фиксируют из­менение окраски.

2.3. РЕАКЦИЯ С УКСУСНЫМ АНГИДРИДОМ И КОНЦЕНТРИРОВАННОЙ СЕРНОЙ КИСЛОТОЙ (РЕАКЦИЯ ЛИБЕРМАНА —БУХАРДА)

Порядок проведения анализа. В пробирку с притертой пробкой помещают 2 см³ раствора холестерина в хлороформе массовой до­лей 0,3 %, добавляют 5—10 капель уксусного ангидрида и несколь­ко капель концентрированной серной кислоты. Фиксируют изме­нение окраски смеси.

После выполнения экспериментальной части работы студен­ты кратко описывают в тетради условия и эффект качественных реакций, самостоятельно анализируют экспериментальные дан­ные, формулируют выводы и заключение по работе. Наблюдения рекомендуется представить в виде таблицы:

Реакция	Источник холестерина	Полученный эффект	Выводы
Реакция с серной кислотой (реакция Залковского)
Реакция со смесью формалина и кон­центрированной серной кислоты
Реакция с уксусным ангидридом и концентрированной серной кислотой (реакция Либермана — Бухарда)

149

3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРОЛА

.Материалы, реактивы и оборудование. Раствор хлорного железа (0,125 г FeCl; ■ бН-,0 растворяют в 100 см^? ледяной уксусной кис­лоты); этт1дацетат"(СН.—СОО—-С₂Н₅); уксусный ангидрид, хлоро­форм; стандартный раствор (1,8 г/дм³) холестерола (180 мг холе­стерола растворяют в 100 см³ этилового этанола); реактив А; шта­тив с пробирками; пипетки; микропипетки: цилиндры; колба; термостат (37 °С); фотоэлекгроколориметр.

3.1. РЕАКЦИЯ С ХЛОРНЫМ ЖЕЛЕЗОМ

Подготовку проб см. п. 2 настоящей работы.

Порядок проведения анализа. Метод основан на взаимодействии хлорного железа со стеролами с образованием продукта пурпурно­го цвета в присутствии этилацетата и серной кислоты.

В пробирку с пришлифованной пробкой помещают I см³ раствора стеролов в хлороформе, приливают 2 см³ этилацетата, затем 2 см³ раствора хлорного железа, перемешивают и добавля­ют 3 см³ концентрированной H₂S0₄, смесь снова осторожно пе­ремешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температу­ре. Окрашенный раствор колориметрируют при длине волны 540 нм. Количество холестерина определяют по калибровочно­му графику.

Построение калибровочного графика. В качестве стандартных используют растворы эргостерола или холестерола в хлороформе с содержанием этих веществ от 10 до 100 мкг, проводят качествен­ную реакцию в соответствии с описанием метода, колориметриру­ют при длине волны 540 нм и строят график D = Дс), где с —- кон­центрация холестерола (эргостерола).

3.2. МЕТОД ЛИБЕРМАНА—БУХАРДА

Подготовку проб см. п. 2 настоящей работы.

Порядок проведения анализа. Стеролы в присутствии де­гидратирующего агента (серной кислоты) реагируют с уксус­ным ангидридом, образуя конденсированные продукты зелено­го цвета.

В пробирку с пришлифованной пробкой помещают 1 см³ раствора стеролов в хлороформе, прибавляют 0,7 см³ уксусного ангидрида и 0,1 см³ концентрированной H₉S0₄. Содержимое пробирки перемешивают, доводят его объем до 5 см³ хлоро­формом и оставляют на 15—20 мин в темноте. Окрашенный раствор колориметрируют против контроля при длине волны

150

610 им. Содержание етеролов определяю! по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. В качестве стандартного используют растворы эргостерола или холестерола в хлороформе с содержанием этих веществ от 50 до 250 мкг. Затем проводят цвет­ную реакцию согласно описанию метода, колориметрируюг при длине волны 610 нм и строят график D —,/[с).

3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРОЛА В ПЛАЗМЕ (СЫВОРОТКЕ) КРОВИ

Подготовка проб. Плазму или сыворотку крови получают центрифугированием или сепарированием с частотой вращения 25—42 с"¹ соответственно стабилизированной или дефибриниро- ванной крови убойных животных в течение 5—8 мин.

Приготовление реактивов. Реактив А: смесь ледяной уксус­ной кислоты (30 см³), уксусного ангидрида (150 см³) и концентри­рованной серной кислоты (30 см³) в соотношении 1:5:1 необхо­димо готовить при постоянном охлаждении. Серную кислоту сле­дует добавлять в последнюю очередь, очень медленно, постоянно перемешивая. Хранить реактив А следует в холодильнике в посуде из темного стекла с притертой пробкой.

Порядок проведения анализа. В сухую пробирку вносят 0,1 см³ плазмы (сыворотки) крови, быстро добавляют 2,1 см³ реактива А, немедленно перемешивают, 10 раз встряхивают и помещают в тер­мостат при 37 °С. Через 20 мин смесь в пробирке окрашивается в зеленый цвет. Фотометрируют против воды при использовании красного светофильтра.

Молярную концентрацию холестерола в исследуемой пробе определяют по оптической плотности с помощью калибровоч­ного графика.

Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора холестерола (1,8 мг холестерола в 1 см³) отбирают по 0,05; 0,1; 0,15; 0,20; 0,25 см³ и добавляют реактив А до объема 2,2 см³ в каждой пробирке. При этом в пробах будет содержаться соответственно 0,09; 0,18; 0,27; 0,36; 0,45 мг/см³ холестерола. После добавления ре­актива А пробирки энергично встряхивают и помещают в термостат при 37 °С, через 20 мин смесь фотоколориметрируют с использова­нием красного светофильтра. Строят график D= f[c).

Молярную концентрацию холестерола в плазме (сыворотке) крови (ммоль/дм³) определяют по формуле

М = с- 1000-0,0258, (1.28)

где с — концентрация холестерола в пробе, найденная по калибровочному графи­ку, мг/см³; 1000 — коэффициент пересчета на объем пробы 1 дм²; 0,0258 — коэф­фициент пересчета в систему СИ.

151

IV iy ii.i;i I жмиеримсн гальныч исследовании tJщкс11р>'клl. се 'л ос i ич i оль л о (])(')[ >м \ л л р\ к > 1 мы но. 11 >i и заключение по работе, перпмсл пальпые ланные сводят и таблиих:

Молярная кошкянрл пня чолесюрпнл н т. следуемом оора лю. ммоль/'лм

Лабораторная работа № 23

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ЖИВОТНЫХ ЖИРОВ

Цель работы. Приобрести практический навык при анализе жирнокислотного состава животных жиров.

Задачи. Провести подготовку проб методом экстракции и путем переэтерификации глицеридов в метиловые эфиры жирных кис­лот, проанализировать жирные кислоты методом газожидкостной хроматографии и идентифицировать эфиры жирных кислот.

Объекты исследования. Образцы мяса различных видов и сортов, субпродукты I и II категорий различных животных, шпик и жир- сырец с различных анатомических участков, жиропродукты.

Материалы, реактивы и оборудование. Абсолютный метанол; хлороформ; раствор гидроксида калия массовой долей 10 % в аб­солютном метаноле; гексан; раствор фенолфталеина в этаноле массовой долей 1 %; диэтиловый эфир; безводный сульфат нат­рия; раствор метилата натрия массовой долей 5 %; колба с воздуш­ным холодильником; делительная воронка; конические колбы вместимостью 50 см³; склянка с притертой пробкой; песчаная баня; вакуум-сушильный шкаф и газовый хроматограф.

Методические указания. Важным показателем пищевой ценнос­ти жиров является их жирнокислотный состав. Такие полинена­сыщенные жирные кислоты, каклинолевая (С₁₈.₂) и линоленовая (С_]8.₃), не синтезируются в организме. Линолевая кислота являет­ся предшественником образующейся в организме арахидоновой кислоты (С₂₀.₄). Полиненасыщенные жирные кислоты относятся к незаменимым компонентам пищи. Они обладают витаминной активностью, принимают участие в регуляции многих процессов в организме и образовании клеточных мембран.

Хроматография — физико-химический метод разделения жид­ких или газообразных смесей, который основан на различии в рас­пределении разделяемых веществ между двумя фазами. При ана­лизе жиров методом хроматографии в качестве подвижных фаз ис­пользуют жидкости или газы. Особую популярность получили га­зожидкостные хроматографы. Разделение анализируемых соеди­

152

нении основано на различном рас! воримое гп компонентов гаю вой смеси в жидком неподвижной фазе, которая нанесена на твер­дый носитель, заполняющий колонку.

Исследуемые вещества движутся по колонке с помощью газа-носителя (азот, аргон, гелий), не вступающего в реакцию с компонентами анализируемой пробы и не растворяющегося в жидкой фазе. Газ подается из баллонов постоянно и поддер­живается на определенном уровне при помощи специального игольчатого вентиля. Скорость подачи газа измеряют, опреде­ляя время истечения заданного объема. Жидкая фаза в ГЖХ должна быть нелетучей, устойчивой к температуре, при которой производят анализ, иметь невысокую вязкость, хорошо раство­рять компоненты разделяемой смеси. В качестве жидкой непод­вижной фазы часто используют органические соединения с вы­сокой температурой кипения. Выбор фазы зависит от природы исследуемого вещества. При разделении соединений с равной полярностью и различными точками кипения используют не­полярную жидкую фазу — сквалан, высоковакуумные смазки апиезон L и апиезон М. Для разделения веществ с различной полярностью (жирных кислот, спиртов) применяют полярные жидкости — полиэтиленгликоли, сложные эфиры углеводов и производные этилендиаминов.

Неподвижную жидкую фазу закрепляют на инертном грану­лированном твердом носителе и помещают в узкую стальную или стеклянную колонку, через которую пропускают подвижную фазу. Хроматографическая колонка представляет собой спираль­ные трубки диаметром 0,2—1 см и длиной 1—20 см.

Твердый носитель жидкой фазы должен быть химически инертным по отношению к анализируемому веществу, обладать относительно большой поверхностью (оптимальная поверхность носителя 5—20м²/г). Чаще всего в качестве носителей использу­ют природные алюмосиликаты, цеолит-545, силикагель (хромо- сорб), силоцел С-22 в форме шариков или пластинок.

Схема газожидкостного хроматографа приведена на рис. 1.39.

Рис. 1.39. Схема газожидкост­ного хроматографа:

1 — пламенно-ионизапионный де­тектор; 2—усилитель; J— самопи­шущий потенциометр; 4— инте­гратор; 5 — газовый баллон с но­сителем; 6 — хроматографическая колонка; 7~ регулятор температу­ры в термостате; 8— термостат

153

"Гак как образец должен поступать в колонку в iазообразном виде, то между дозатором и колонкой устанавливают подогрева­тель. обеспечивающий мгновенное испарение образца, темпера­тура в котором поддерживается на 30—-50 °С выше, чем темпера­тура в колонке.

Ввиду того что скорость продвижения компонентов смеси по хроматографической колонке зависит от температуры, колонку помещают в термостат (жидкостный, паровой, воздушный). Чаше всего используется воздушный термостат, позволяющий работать в области высоких температур.

Образующаяся газовая смесь попадает в верхнюю часть ко­лонки и перемещается вдоль нее газом-носителем. Температура колонки поддерживается на уровне, обеспечивающем газообраз­ное состояние анализируемой смеси. Выходящие из колонки компоненты попадают в детектор и регистрируются в виде полос на ленте самописца.

Сущность метода состоит в том, что каждый компонент разделя­емой смеси при определенной температуре в парообразном состоя­нии с определенной скоростью с помощью газа-носителя переме­щается по колонке, заполненной порошкообразным носителем, пропитанным неподвижной фазой (нелетучей жидкостью).

Хроматограмма смеси представляет собой кривую в виде ряда пиков, число которых соответствует числу разделяемых компо­нентов. Чем больше площадь пика, тем больше содержится данно­го вещества в пробе. Последовательность выхода компонентов за­висит в основном от коэффициентов их распределения между жидкой неподвижной и газообразной подвижной фазами.

Количество вещества определяют по площади (иногда по высоте) пика на диаграммной ленте самописца. Площадь пика измеряют планиметрическим способом либо умножением высоты пика h на ширину b, которую он имеет на половине высоты (рис. 1.40). Неко­торые газожидкостные хроматографы (ГЖХ) снабжены интегратора­ми, которые измеряют относительное время удержания и определяют площади пиков.

При анализе смесей жирных кислот их переводят в метиловые эфиры, которые явля­ются более летучими, чем свободные жирные кислоты, и не обладают способностью диме- ризоваться. Кроме того, при хроматографиро- вании эфиров облегчается разделение насы­щенных жирных кислот и ненасыщенных с тем же числом углеродных атомов. Эфиры на­сыщенных жирных кислот с прямой цепью уг­леродных атомов выходят из колонки в поряд­ке повышения их температуры кипения. При Рис. 1.40. Измерение постоянных условиях работы время и порядок

площади пика выхода кислот из колонки всегда одинаковы.

154

Этот метод основан на предварительном кипячении пробы липидов в абсолютном метаноле с меi планом натрия с последующим экстра­гированием полученного продукта лпэтпловым эфиром.

При анализе глицеридов получают метиловые эфиры методом переэтерификапии.

Подготовка проб, Сначала проводят предвари 1ельную экстрак­цию липидов. Для этого 40 г измельченного образца помещают в колбу с герметически закрывающейся пробкой, добавляют 130 см³ метанола, перемешивают и измельчают на гомогенизаторе в тече­ние 1—2 мин до получения однородной массы. Затем к гомогена- ту добавляют 65 см³ хлороформа и встряхивают в течение 10 мин, после чего к смеси добавляют еще 65 см³ хлороформа и вновь встряхивают, но уже в течение 5 мин. К полученной смеси прили­вают 65 см³ дистиллированной воды и встряхивают в течение 30 с. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр под не­большим разрежением на воронке Бюхнера. Во время фильтрации желательно подавать струю диоксида углерода или азота на гомо- генат, находящийся в воронке.

Остаток вместе с фильтром и небольшим кусочком фильтро­вальной бумаги, которым вытирают воронку, переносят в ту же смесительную колбу и повторно экстрагируют 100 см³ хлороформа в течение 10 мин. Смесь фильтруют в общую колбу. Колбу и оста­ток промывают 50 см³ хлороформа и весь фильтрат собирают в мерный цилиндр вместимостью 500 см³. Слои разделяют в дели­тельной воронке, отбирают нижний хлороформный слой, выпари­вают на роторном испарителе и получают жир, подлежащий даль­нейшему анализу. Для этого жирные кислоты переводят в свобод­ное состояние и получают их метиловые эфиры по одному из опи­саний, предложенных ниже.

1. Пробу липидов массой 0,5 г помещают в колбу вместимос­тью 150 см³, добавляют 10 см³ абсолютного метанола, вводят 0,05 см³ раствора метилата натрия массовой долей 5 %, присое­диняют воздушный холодильник и кипятят на песчаной бане при температуре 75—80 °С в течение 1,5 ч. Затем отгоняют избыток этанола, содержимое колбы переносят в делительную воронку, ополаскивая колбу 2 раза 5 см-> диэтилового эфира. В воронку добавляют 2 см³ воды и 3 раза экстрагируют метиловые эфиры ди- этиловым эфиром, каждый раз используя по 10 см³. Эфирные вы­тяжки промывают водой до нейтральной реакции по фенолфтале­ину, сушат безводным сульфатом натрия и фильтруют. Раствори­тель отгоняют, эфиры сушат в вакуум-сушильном шкафу при ком­натной температуре, а затем хранят в герметически закрытых склянках на холоде в темноте.

2. Пробу липидов массой 0,1 г помешают в толстостенную кол­бу с притертой пробкой, добавляют 5 см³ абсолютного метанола и 0,22 см³ раствора гидроксида калия в абсолютном метаноле массо­вой долей 10 %. Колбу закрывают пробкой, которую прочно при­

155

кручивают медной проволокой, помешают на водяную баню при температуре кипения и нагревают в течение 5—7 мин. Пос­ле охлаждения в колбу добавляют 10 см- воды. Полученную эмульсию количественно переносят в делительную воронку и метиловые эфиры экстрагируют гексаном (трижды по 20 см³). Объединенный гексановый экстракт промывают несколько раз водой порциями по 20 см³ до нейтральной реакции по фенол­фталеину.

При метилировании жирных кислот в реакционную смесь можно добавить гидроксид калия из расчета 1,1 см³ раствора гид- роксида калия в абсолютном метаноле массовой долей 10 % на 0,1 г жира и содержимое нагреть в аналогичных условиях в те­чение 1 мин.

Порядок проведения анализа. В хроматограф вводят образец. Для этого пробу метиловых эфиров набирают в инъекционный шприц, прокалывают им колпачок дозатора и вводят содержимое. Момент ввода пробы фиксируется на нулевой линии.

Самописец прибора вычерчивает хроматограмму. Если в смеси отсутствует та или иная жирная кислота, то на хроматограмме бу­дет отсутствовать соответствующий ей пик.

Для качественной идентификации параллельно при тех же ус­ловиях (скорость движения ленты, скорость газа-носителя, темпе­ратура и т. д.) вычерчивают хроматограмму известной стандартной кислоты, чаще всего пальмитиновой.

В случае проведения анализа на хроматографе с плазменно- ионизационным детектором метиловые эфиры жирных кислот разделяют при следующих условиях: колонку длиной 3 м и внут­ренним диаметром 3 мм заполняют 15%-ным полиэтиленгли- кольсукцинатом на цеолите-545 с размером зерна 60—80 меш (число отверстий сита в одном квадратном дюйме), скорость газа-носителя (азота) 30 см³/мин. Разделение осуществляют в ре­жиме линейного программирования температуры при скорости нагревания 4 °С/мин от 80 до 202 °С и в изотермическом режи­ме — при 202 °С. Пробу объемом 1—2 мкл вводят в хроматограф микрошприцем на 10 мкл.

Качественный анализ компонентов смеси метиловых эфиров жирных кислот липидов проводят, используя метчики иден­тифицированных эфиров чистых кислот. Количество каждого компонента в данной пробе определяют следующим образом. На хроматограмме проводят базовую линию, соединяющую основа­ния всех пиков. Затем измеряют высоту каждого пика и его ши­рину на половине высоты. После этого вычисляют площадь пика (чаще по площади треугольника, можно использовать и другие способы расчета площадей пиков). Сумму площадей всех пиков метиловых эфиров кислот принимают за 100%. Зная, сколько образца было введено в колонку хроматографа, можно рассчи-

156

тагь количество каждой кислоты, содержащейся в данном образ­це. по формуле

где 5 — площадь пика определяемого компонента; 1S_U — сумма площадей пиков всех компонентов.

Полученные экспериментальные данные фиксируют в тетради, анализируют результаты, формулируют заключение по работе. Экспериментальные данные рекомендуется оформить в виде таб­лиц, формы которых приведены ниже.

Образец, источник получения	Жирная кислота	Формула	Массовая доля, % к сумме

Жирные кислоты, % к сумме	Объекты исследования
	1	2	3	4	5 j 6

Насыщенные (H)

Мононенасыщенные (М)

Полиненасыщенные (П)

Соотношение H : М : П

Неидентифииированные компоненты

Лабораторная работа № 24

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛИКОГЕНА В ЖИВОТНЫХ ТКАНЯХ

Цель работы. Приобрести практический навык количественно­го определения гликогена в животных тканях.

Задачи. Получить гликоген из анализируемых образцов тка­ней; провести качественную реакцию с антроновым реактивом; определить светопоглощение окрашенных растворов с последу­ющим определением концентрации гликогена по калибровоч­ному графику.

Объекты исследования. Мышечная ткань и печень крупного ро­гатого скота.

Материалы, реактивы и оборудование. Растворы гидроксида ка­лия массовыми долями 30 и 50 %; растворы этанола массовыми

157

долями '-Ъ. %. (iD п 80⁽-V: '-xjjnp: кониенгрированная H,SO, (х.ч.): антрон: 1лпкоген (или глюкоза): свежеприготовленный раствор антрона: пенгрпфиа лабораторная: сифон: стеклянные пипетки: водяная баня, стеклянные пробирки: лед: спектрофотометр или ф ото э л е кт р о к о л о р и м е тр.

Приготовление реактивов. Р а с т вор антрона: 0,2 г ан­трона помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, раство­ряют и доводят до метки раствором серной кислоты массовой долей 95 %. После выдержки в течение 1 ч раствор готов к при­менению.

Методические указания. Количество гликогена в свежих мыш­цах указывает на упитанность животного, а динамика количест­венного изменения гликогена в процессе хранения и переработки свидетельствует о глубине автолитических превращений.

Количество гликогена легко определить по цветной реакции с антроном. Метод сравнительно легкий и пригоден для массовых определений.

Метод состоит из следующих основных операций: гидролиза белков щелочью, выделения гликогена из раствора этанолом, про­мывания гликогена и его растворения, реакции с антроном (раз­витие окраски) и измерения интенсивности окраски.

При нагревании образцов тканей с концентрированным раст­вором щелочи происходит гидролиз белков, при этом гликоген выделяется из клеток. Гликоген не растворяется в этаноле, он выпадает в осадок при добавлении довольно большого его объема. Добавление нескольких капель концентрированной серной кис­лоты способствует осаждению гликогена вследствие образования сульфата аммония.

Нагревание промытого осадка гликогена с антроном (высо­коспецифичным реактивом на углеводы), растворенным в кон­центрированной серной кислоте, приводит к гидролизу глико­гена до глюкозы вследствие каталитического действия серной кислоты и к развитию окраски при реакции между глюкозой и антроном по схеме

о о

По интенсивности окраски судят о количестве глюкозы. Раз­вившаяся окраска пропорциональна количеству взятой глюкозы в пределах от 10 до 100 мкг в пробе.

158

Окрашенный от зеленого ло сине-зеленого цвета продукт ре­акции имеет максимум поглощения при длине волны 620 нм. Интенсивность окраски раствора измеряют на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре с красным светофильтром с макси­мумом пропускания при той же длине волньв

Подготовка проб. При использовании в качестве объекта ис­следования мышечной ткани в центрифужные пробирки разме­ром 25 х 160 мм вносят 5 см³ раствора гидроксида калия массовой долей 50 % и около 2.5 г пробы, взвешенной на технических ве­сах с точностью до ± 0,01 г. Пробирки помещают в специальный штатив, вместе с которым их ставят в водяную баню при темпе­ратуре кипения. После образования однородного раствора (пос­ле того как все частички мяса растворились) пробирки охлажда­ют, добавляют 5 см³ дистиллированной воды, осаждают гликоген 40 см³ этанола 96об.% и вносят несколько капель концентриро­ванной серной кислоты.

При анализе печени крупного рогатого скота в пробирку из мо­либденового стекла (или стекла пирекс) размером 20 х 150 мм поме­щают навеску тщательно измельченного образца массой 1,0 г, до­бавляют 30 см³ раствора гидроксида калия массовой долей 30 % и нагревают на сильно кипящей водяной бане в течение 20 мин.

По истечении времени пробирку охлаждают в холодной воде, содержимое количественно переносят в мерную колбу и доводят объем дистиллированной водой до метки. Вместимость мерной колбы подбирают в зависимости от возможного содержания гликогена в печени. Если анализируют измельченную при ох­лаждении печень только что убитого животного, то выбирают колбу вместимостью 200—500 см³, для анализа печени, хранив­шейся длительное время, используют колбу вместимостью 25— 50 см³. Гидролиз ведут в течение 24 ч.

Порядок проведения анализа. По истечении 24 ч содержимое пробирок центрифугируют в течение 30 мин при частоте враще­ния 50 с^-1, жидкость над осадком сливают тонким сифоном или осторожно удаляют пипеткой. Осадок последовательно промыва­ют 15 см³ раствора этанола с объемными долями 60, 80 и 96 %, а затем эфиром.

Для отделения промывных жидкостей пробирки с содержимым центрифугируют 30 мин. После каждого центрифугирования жид­кость над осадком сливают, пользуясь вышеуказанным приемом. При обработке эфиром центрифугирования не требуется, после 10 мин настаивания эфир сливают из пробирки, а его следы удаля­ют на водяной бане.

Каждую порцию промывной жидкости добавляют не сразу, а в два приема. Сначала вносят небольшую часть жидкости и тща­тельно распределяют в ней осадок, перемешивая его стеклянной палочной, а затем добавляют оставшийся объем, тщательно смы­вая в пробирку приставшие к палочке частицы.

159

После удаления следов эфира к остатку юбавлякп 5см-' юрячеп воды, раствор перемешивают вращательным движением пробирки, и нейтрализуют соляной кислотой ио лакмусу (сначала двумя каплями концентрированной H₉S0₄, а затем H₂S0₄ массовой долей 2 9с).

Из пробирки раствор гликогена переносят в мерную колбу со­ответствующей вместимости (см. подготовку проб). Для проведе­ния цветной реакции в две пробирки молибденового стекла раз­мером 30x200 мм помещают аликвотные части раствора гликоге­на (например, 0,5 и 1,5 см³), доливают до 5 см³ дистиллированной водой и погружают в водяную баню со льдом. Осторожно, непре­рывно помешивая, приливают тонкой струей 10 см³ свежеприго­товленного раствора антрона. Затем жидкости еще раз осторожно перемешивают вращательным движением и пробирки помещают на 10 мин в сильно кипящую водяную баню. По окончании нагре­вания пробирки быстро охлаждают в воде со льдом и измеряют оптическую плотность по отношению к контрольному раствору. Образовавшаяся зеленая окраска при использовании реактивов высокой чистоты устойчива в течение 4—5 ч.

Контрольный опыт проводят при аналогичных условиях, по­мещая в пробирку 5 см³ дистиллированной воды и 10 см³ раство­ра антрона.

Оптическая плотность контрольного раствора, измеренная от­носительно серной кислоты, не должна превышать 0,08.

Построение калибровочного графика. Готовят стандартный раст­вор на основе тщательно очищенного и высушенного в эксикаторе гликогена, полученного из тканей только что убитого кролика, или пользуются химически чистым препаратом глюкозы. Для перевода глюкозы в гликоген результаты определения делят на 1,11.

Навеску гликогена массой 16 мг растворяют в теплой дистилли­рованной воде в мерной колбе вместимостью 200 см³, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем до метки и тщательно перемешивают. 1 см³ стандартного раствора содержит 0,08 мг гли­когена. Из раствора готовят серию рабочих растворов для построе­ния калибровочного графика. Рекомендуемые объемы стандарт­ного раствора гликогена для построения калибровочного графика приведены ниже.

Объем,см'

Масса гликогена, мг

раствора гликогена

воды

антрона

0,01 0,02 0,04 0,06 0,08 0,12 0,16 0,20

0,125 0,25 0,50 0,75 1,00 1,50 2,00 2,50

4,875

4,75

4.50

4,25

4,00

3,50

3,00

2,50

10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0

160

Для построения калибровочного графика необходимо провести не менее трех серии определении, используя каждый раз вновь приготовленный раствор гликогена иди вискозы.

При помощи калибровочного графика находят концентрацию гликогена во взятом на цветную реакцию растворе, а затем пере­считывают на содержание его в мясе (мг 9с) по формуле

X

а -25 100 Ут

(1.30)

где а — содержание гликогена по калибровочному графику, мг: 25 — вмести­мость мерной колбы, в котором был растворен осадок гликогена; 100 —множи­тель перевода в проценты; V— объем исследуемого раствора, взятого на цветную реакцию, см³; т — масса навески мяса. г.

Полученные экспериментальные и расчетные данные сводят в таблицу:

Образец	ИспользусмыГ! метол опреде­ления	От ическая ПЛОТНОСТЬ раствора	Содержание гликогена по калибровочному графику	Массовая доля гликогена и образце, %

Опираясь на теоретические знания, самостоятельно делают вы­воды и формулируют заключение.

Лабораторная работа № 25

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

Цель работы. Приобрести практический навык определения количества молочной кислоты.

Задачи. Выделить молочную кислоту из мышечной ткани мето­дом экстракции; провести качественные реакции; определить оп­тическую плотность окрашенных растворов и рассчитать массовое содержание молочной кислоты в исследуемом образце.

Объекты исследования. Мясо или мышечная ткань различных видов животных разных сроков хранения.

Методические указания. В аналитической практике применяются различные методы определения молочной кислоты, наиболее рас­пространенными среди которых являются методы, основанные на качественных реакциях с последующим фотометрированием.

Метод определения по цветной реакции с вератролом является сравнительно быстрым и пригодным для массовых определений. Он состоит из следующих основных операций: осаждения белков, углеводов, нагревания с серной кислотой, развития цветной реак­ции с вератролом, измерения интенсивности окраски.

161

Волки ооажлаю1 расгнором Meтафосфорноп кислопя массовом долей 5 /с. Промежуточные продукты распада бодкон мегафос формой кислотой не осаждаются.

Для осаждения углеводов и отчасти промежуточных продуктов распада белка применяют сульфат меди и гидрат окиси кальция, углеводы осаждаются в виде сахаратов.

При нагревании с концентрированной серной кислотой молоч­ная кислота превращается в ацетальдегид:

СН, СН;

I ' I

СНОН + H₂S0₄ —с = о

соон н

Образовавшийся ацетальдегид при реакции с вератролом дает соединение красного цвета.

Окрашенный в красный цвет продукт реакции имеет мак­симум поглощения при длине волны 520 им. Интенсивность окраски раствора измеряют на спектрофотометре или фото- электроколориметре со светофильтром с максимумом про­пускания при вышеуказанной длине волны (зелено-желтый или зеленый).

Фильтрат должен быть прозрачным. Для того чтобы убедиться в полном удалении белков, можно поместить несколько кубичес­ких сантиметров фильтрата в пробирку и добавить к нему равный объем раствора сульфосалициловой кислоты массовой долей 20 % (в присутствии следов белка появляется муть).

Метод количественного определения молочной кислоты с л-оксидифенилом основан на измерении интенсивности окраски соединения, образующегося в процессе реакции ацетальдегида с л-оксидифенилом в присутствии серной кислоты.

Белки удаляют осаждением трихлоруксусной кислотой, а углеводы — гидроксидом кальция в присутствии сульфата меди; уксусный альдегид, образующийся из молочной кис­лоты при нагревании с серной кислотой, дает в присутствии меди цветную реакцию с л-оксидифенилом (окрашивается в фиолетовый цвет).

Ацетальдегид образуется при нагревании молочной кислоты с минеральными кислотами. При его взаимодействии с двумя моле­кулами и-оксидифенила образуется 1,1-ди(оксидифенил)этан, ко­торый в присутствии H₂S0₄ окисляется в продукт фиолетового цвета с максимумом поглощения при длине волны 574 нм. Состав окрашенного производного неизвестен.

162

С'Н:(ЛЮН("(К)Н • Ch.CiKi ПСОПН

/~v_/ \

СН;СНО + 2НО (' ^х) (' ^Ч) —^Н;С-СН

■-СЮ

1,1 —лн(окспд]1фсш1л )эт;ш

Метод позволяет определить молочную кислоту в количествах от 0.03 до 0,2 мкмоль в пробе.

1. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ ПО ЦВЕТНОЙ РЕАКЦИИ С ВЕРАТРОЛОМ

Материалы, реактивы и оборудование. Свежеприготовленный раствор метафосфорной кислоты массовой долей 5 %; насыщен­ный на холоде раствор медного купороса и затем разведенный водой в соотношении 1:1; растертый в порошок гидроксид каль­ция; раствор вератрола массовой долей 0,125 % в растворе этанола 96 об.%; концентрированная серная кислота (пригодность пос­ледней устанавливают по отсутствию желто-зеленой окраски при стоянии в течение нескольких минут смеси, состоящей из 3 см³ кислоты с 0,1 см³ спиртового раствора вератрола массовой долей 0,125 %); молочная кислота или лактаты (цинка, лития) для пост­роения калибровочного графика; раствор сульфосалициловой кис­лоты массовой долей 20 %; спиртовой раствор а-нафтола массо­вой долей 10%; колбы Эрленмейера вместимостью 50 см³; бу­мажные фильтры; стеклянные пробирки; штатив; микропипетки; спектрофотометр.

Подготовка проб. Мясо или мышечную ткань предварительно измельчают и помещают в стакан или бюкс с притертой крышкой. Навеску образца берут из стакана или бюкса по разнице масс с точностью до ±0,1 г и помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, в которую добавляют 40 см³ дистиллированной воды, за­крывают пробкой и встряхивают в течение 5 мин для равномер­ного распределения мяса и жидкости. Затем в ту же колбу добав­ляют 10 см³ раствора свежеприготовленной метафосфорной кис­лоты массовой долей 5 %, хорошо встряхивают, доводят объем во­дой до метки и через 15 мин фильтруют.

163

11орядок проведения анализа. Фильтра! обьемом И) см-' помеща­ют в колбочку Эрленмеиера вместимостью примерно 50 см-" и до­бавляют к нему 2.5 см³ рас твора медного купороса и 3 г растертого в порошок гидроксида кальция. Смесь должна приобрести интен­сивный бирюзовый цвет. При зеленовато-голубой окраске, указы­вающей на недостаточную щелочную реакцию, добавляют еще не­большое количество гидроксида кальция. Смесь оставляют на 1 ч, время от времени взбалтывая.

По истечении 1 ч жидкость отфильтровывают от осадка через бу­мажный фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным и бесцветным. С целью проверки полноты осаждения углеводов проводят реак­цию с а-нафтолом. Для этого несколько кубических сантиметров фильтрата помещают в пробирку, добавляют одну каплю раствора ос-нафтола массовой долей 10% и наслаивают 1 см³ концентриро­ванной серной кислоты, в присутствии сахара на границе появляет­ся красно-фиолетовое кольцо. В случае положительной реакции измеряют количество фильтрата и вновь повторяют осаждение, ис­пользуя уже половину объема раствора медного купороса и полови­ну гидроксида кальция по отношению к первоначальным объемам. Избыток медного купороса влияет на устойчивость окраски.

Для реакции с серной кислотой берут пипеткой точно отмерен­ный объем фильтрата, переносят в пробирку размером 30 х 200 мм из молибденового (или термоустойчивого) стекла. Как правило, берут 0,05—0,5 см³ фильтрата в зависимости от содержания мо­лочной кислоты в мясе. Небольшие объемы фильтрата (0,05— 0,1 см³) отбирают микропипеткой. Если исследуют парное мясо, то для реакции можно использовать 0,5 см³ фильтрата если иссле­дуют мясо после суточного созревания — 0,05—0,1 см³.

Если для анализа взято менее 0,5 см³ фильтрата, то его доводят дистиллированной водой до объема 0,5 см³. Пробирки помещают в ледяную воду и по каплям при встряхивании приливают из микро­бюретки 3 см³ концентрированной серной кислоты. Затем пробир­ки помещают в водяную баню при температуре кипения на 4 мин (по секундомеру), после чего охлаждают в ледяной воде 2 мин.

Пробирки ставят в штатив и в каждую микропипеткой добавля­ют 0,1 см³ вератрола. По прошествии 20 мин измеряют оптичес­кую плотность раствора, окрашенного в розовый цвет, на спект­рофотометре при длине волны 520 нм по отношению к воде в кювете с толщиной слоя 1 см. Контрольный раствор готовят од­новременно с опытным, заменяя фильтрат, содержащий молоч­ную кислоту, соответствующим объемом воды. Измерение прово­дят также по отношению к воде.

Одновременно можно проводить анализ 5—6 проб мяса, что со­ставит с параллельными определениями 10—12 пробирок.

Цветная реакция с вератролом достаточно устойчива. Фильтра­ты после осаждения белков можно хранить в холодильнике при 4 °С в течение нескольких дней.

164

При расчете из величины оптической плотности опытною раствора вычитают величину оптической плотности контрольного раствора. Затем по калибровочному графику находят концентра­цию молочной кислоты в 3,6 см³ опытного раствора.

Построение калибровочного графика. Готовят стандартный раствор на основе молочной кислоты или ее содей (лактата ли­тия или цинка), содержащий 0.25 мг молочной кислоты в 1 см³. Каждую из солей берут из расчета на молочную кислоту, напри­мер, при использовании лактата цинка (CHXHOHCOO^Zn навеску массой 169 мг растворяют в воде в мерной колбе вмес­тимостью 500 см³.

Для построения графика готовят серию растворов. Рекомендуе­мые объемы раствора молочной кислоты для построения калибро­вочного графика приведены ниже.

Масса молочном кислоты, мг

раствора молочном кислоты

Объем, см"'

волы	серном кислоты

0,100	0,40	0.10	3.0
0,080	0.32	0,18	3,0
0.060	0,24	0,26	3,0
0,040	0,16	0,34	3,0
0,020	0,08	0,42	3.0
0,010	0,04	0,46	3,0

Опыты повторяют три раза. Каждый раз готовят новый стан­дартный раствор. Для всех растворов в пробирках каждой серии получают величины оптической плотности, по которым после вы­читания показаний контрольного опыта (все спектральные изме­рения делают в сравнении с водой) строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации.

Содержание молочной кислоты (мг %) рассчитывают по формуле

_v д-12,5-100-100

* ⁼ —Flo^—' О-³¹)

где а — содержание молочной кислоты в 3,6 см³ опытного раствора, мг; 12,5 — объем раствора, обработанный гидроксидом кальция, см³; 100 — объем, в кото­ром содержится навеска мяса и д/е/гш-фосфорная кислота; 100 — коэффициент перевода в проценты; V— объем фильтрата после осаждения углеводов, взятый на цветную реакцию, см³; 10 —объем фильтрата после осаждения белков л/е/ио-фосфорной кислотой, взятый на осаждение углеводов, см³; т — масса на­вески мяса, г.

165

2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ ПО ЦВЕТНОЙ РЕАКЦИИ С Л/4Р/4-ОКСИДИФЕНИЛОМ

Материалы, реактивы и оборудование. /7с//;с/-оксидифонил: гпд- роксид натрия (х. ч.); реактив /ш/я/-оксидифенила; растворы тио­сульфата меди массовыми долями 4 и 20%; порошок гидроксида кальция; концентрированная серная кислота (х. ч.): водный раст­вор трихлоруксусной кислоты массовой долей 10 %; лактат цинка (или лития) или титрованная молочная кислота; центрифуга ла­бораторная; пробирки стеклянные; водяная баня; микробюретки; спектрофотометр (фотоэлектроколориметр).

Приготовление реактивов. Реактив пар а-о ксидифе- н и л а: раствор ля/>я-оксидифенила массовой долей 1,5 % в раст­воре гидроксида натрия массовой долей 0,5 %.

Подготовка проб. При использовании качественной реакции с «я/7я-оксидифенилом в ступку вносят 10 см³ раствора трихлор­уксусной кислоты массовой долей 10% и 2—4 г измельченного мяса и растирают его в течение 10 мин. Образовавшуюся суспен­зию переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, используя для этого сначала 20 см³ раствора трихлоруксусной кислоты мас­совой долей 10%, а затем несколько кубических сантиметров дистиллированной воды.

Колбу оставляют на 30 мин при комнатной температуре, встря­хивая через каждые 10 мин, затем объем доводят дистиллирован­ной водой до метки, колбу закрывают пробкой, хорошо переме­шивают содержимое, переносят в центрифужные пробирки, цент­рифугируют с частотой вращения 50 с^-1 в течение 10—15 мин. Центрифугат сливают в сухую колбу, отбирают 25 см³ прозрачной жидкости, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и объем доводят дистиллированной водой до метки.

Порядок проведения анализа. Для осаждения углеводов к 2 см³ разбавленного центрифугата прибавляют 1 см³ раствора сульфа­та меди массовой долей 20 %, дистиллированной водой доводя объем жидкости до 10 см³, приливая воду пипеткой или из бю­ретки, добавляют 1 г растертого в порошок гидроксида кальция, энергично встряхивают, оставляют в покое на 30 мин, время от времени встряхивая, а затем центрифугируют. Центрифугат сли­вают в колбу.

Для проведения цветной реакции аликвотную часть (напри­мер, 1 см³ центрифугата) переносят в пробирку из молибденово­го стекла (или стекла пирекс) размером примерно 25 x 200 мм, добавляют 1 каплю раствора сульфата меди массовой долей 4 % и ставят в ледяную воду (обычно проводят ряд определений). При помешивании добавляют из микробюретки 6 см³ концентриро­ванной серной кислоты, помещают пробирку на 5 мин в водяную баню при температуре кипения, после чего охлаждают в холод­ной воде до 20 °С.

166

В пробирку добавляют O.ic.m-' раствора /ш/;<г/-оксидифенила. очень тщательно и осторожно перемешивают, после чего ставят пробирку на 30 мин в водяную баню при 30 С. изредка слегка встряхивая. По прошествии этого срока пробирку помещают в сильно кипящую водяную баню на 90 с. затем охлаждают в холод­ной воде и измеряют интенсивность окраски, пользуясь спектро­фотометром иди фотоэлектроколориметром. В первом случае из­мерения проводят при длине водны 560 нм. во втором — со свето­фильтром с минимумом поглощения при топ же длине волны. Прибор должен быть включен заранее, измерение проводят по от­ношению к контрольному раствору. Толщина кюветы 1 см.

Контрольный опыт с реактивами проводят, начиная с момен­та осаждения углеводов, для чего используют вместо 2 см-⁵ цент- рифугата мышечной гкани 0,3 см³ раствора трихлоруксусной кислоты и 1,7 см³ дистиллированной воды. Строят калибровоч­ный график.

Построение калибровочного графика. Для приготовления стан­дартного раствора можно пользоваться титрованным раствором молочной кислоты или растворами ее солей (цинковой, литие­вой или другой). При использовании лактата лития навеску мас­сой 133,3 мг переносят в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в 5 см³ серной кислоты, разбавленной в соотноше­нии 1 : 10, объем доводят дистиллированной водой до метки (раствор № 1). 1 см³ раствора № 1 содержит 0,250 мг молочной кислоты. 20 см³ этого раствора пипеткой переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³, и объем доводят дистиллированной водой до метки (раствор № 2). 1 см³ раствора № 2 содержит 0,020 мг молочной кислоты.

Для построения графика готовят серию растворов. Рекомендуе­мые объемы раствора № 2 для построения калибровочного графи­ка приведены ниже.

Объем, см^:

Масса молочной кислоты, мкг

раствора № 2

воды

10

12

6

4

2

0

0

о

8

0.10 0,20 0.30 0,40 0,5 0 0,60 0 0 0

0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 1.00 1,00 1,00

167

С npni отовленными растворами проводят цветную реакцию. Измерение оптической плотности проводят по отношению к дистиллированной воде. Среднюю арифметическую величину оптической плотности растворов последних трех пробирок (см. табл.) вычитают из величины оптической плотности каж­дого основного раствора. Данные наносят на миллиметровую бу­магу, соединяя точки прямой линией.

По калибровочному графику находят концентрацию молочной кислоты в объеме раствора, взятом на цветную реакцию.

Содержание молочной кислоты в мясе (мг%) определяют гго формуле

_{х =} с-10 100 -50 100 1-2-25/77-100 '

где с — концентрация молочной кислоты, найденная по калибровочному графику в соответствии с полученной оптической плотностью, мг/см-'; 10 —объем раствора при осаждении углеводов, ем³; 100— объем разбавлен­ного центрифугата. см-¹; 50 — объем смеси при осаждении белков три­хлоруксусной кислотой, см³; 100 — коэффициент перевода в проценты; 1 — объем раствора после осаждения углеводов, взятый для проведения цветной реакции, см³; 2 — объем разбавленного центрифугата, взятый для осаждения углеводов, см¹; 25 — объем разбавленного центрифугата, взятый для разбавления, см³; т — масса навески мяса, г; 1000 — множитель для перевода в миллиграммы.

Ошибка метода составляет примерно ±5%. Если точно следовать указанной методике, то можно пользо­ваться упрощенной формулой

^ = — -100. (1.33) т

Полученные экспериментальные и расчетные данные оформ­ляют в виде таблицы:

Объект	Метод опре­деления	Оптическая плотность	Концентрация молочном кислоты по калибровоч­ному графику, мг/см3	Содержание молоч­ной кислоты, мг%

Проанализировав результаты, студенты должны сделать выво­ды о длительности хранения и глубине созревания мяса, сформу­лировать общее заключение по работе.

168

Лабораторная работа № 26

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕКТИНА В МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ

Цель работы. Приобрести практический навык определения пектина в мясопродуктах (или растениях).

Задачи. Получить и количественно определить растворимый пектин методом осаждения или фотометрически на основе каче­ственной реакции.

Объекты исследования. Комбинированные (или лечебно-про­филактические) мясопродукты, содержащие пектиновые веще­ства, а также различные источники пектиновых веществ (свекла, морковь, тыква, кабачки и т.д.).

Методические указания. В связи с актуальностью проблемы контроль количества балластных веществ, особенно при произ­водстве комбинированных продуктов питания, приобретает осо­бое значение.

В основе химической структуры пектиновых веществ лежит высокомолекулярная полигалактуроновая кислота, которая состо­ит из остатков галактуроновой кислоты, связанных кислородным мостиком между первым и четвертым углеродными атомами.

В растениях пектиновые вещества содержатся в виде протопек­тина, химическая природа которого еще недостаточно изучена. Полагают, что пектин связан с арабаном клеточной стенки, с цел­люлозой и с ионами металлов; нерастворимый протопектин пере­ходит в растворимый под влиянием разбавленных кислот или фермента протопектиназы. Растворимый пектин представляет со­бой сложный эфир полигалактуроновой кислоты и метилового спирта следующего строения:

соосн, соосн, соосн,

I I I

с —о „ с —о „ с—о „

пл пл П/'

ОС С О С С О С СО

J £\?^н V/U V/U V/U

с —С с —С с—с

II II II

H OH H OH н он

Растворимый пектин расщепляется разбавленными щелочами или при каталитическом воздействии фермента пектинэстеразы (пектазы). В результате гидролиза отщепляются метанол и пек­тиновая (полигалактуроновая) кислота. Пектиновая кислота рас­щепляется ферментом полигалактуроназой, в результате гидроли­за которой образуется галактуроновая кислота.

169

В настоящей работе предлагается воспользоваться одним и; двух методов определения пектина: путем осаждения по пектату кальция; по характерной для урановых кислот реакции с карба- золом в концентрированной серной кислоте. В первом случае предварительно проводят гидролиз пектиновых веществ с по­следующим осаждением полигалактуроновой кислоты в виде пектата кальция. Второй метод предусматривает действие кон­центрированной H₂S0₄ на пектиновые вещества с образовани­ем фурфурола, который вступает во взаимодействие с карба- золом и образует окрашенное соединение. Применение бората способствует быстрому развитию окраски, повышая ее стабиль­ность (сохраняется 16 ч), снижая влияние различных окислите­лей. Перед реакцией пектиновых веществ с карбазолом необхо­димо проводить деметоксилирование их раствором гидроксида натрия, что значительно повышает воспроизводимость и чув­ствительность анализа.

1.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕКТИНА ТЕРМОГРАВИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

ПО ПЕКТАТУ КАЛЬЦИЯ

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор цитрата аммония массовой долей 10%; раствор NaOH молярной концентрацией 0,1 моль/дм³; раствор уксусной кислоты молярной концентрацией

1 моль/дм³; раствор хлорида кальция молярной концентрацией

2 моль/дм³; раствор AgN0₃ молярной концентрацией 0,1 моль/дм³; колбы Эрленмейера вместимостью 250 и 500 см³; фарфоровая ступ­ка; мерные колбы вместимостью 500 см³; водяная баня; шюттель- аппарат; центрифуга; обратный холодильник; бумажные фильтры; бюксы; сушильный шкаф; аналитические весы.

Подготовка проб. 25 г свежего материала растирают с битым стеклом в ступке до совершенно однородной массы и переносят в колбу Эрленмейера, заливают 100 см³ воды, нагретой до 45 °С (не выше), и выдерживают (при периодическом взбалтывании) 30 мин при указанной температуре на водяной бане. Затем колбу плотно закрывают каучуковой пробкой и энергично взбалты­вают в течение 15—20 мин в шюттель-аппарате. После этого содержимое колбы центрифугируют и собирают прозрачный раствор пектина, который исследуют на желеобразующую спо­собность. В плотном остатке определяют количество нераство­римого пектина (протопектина). При определении протопекти­на плотный остаток подвергают дополнительной двукратной об­работке водой; второй раз заливают 75 см³ дистиллированной воды, третий — 50—60 см³. Промывные воды используют для до­бавочного извлечения из них растворимого пектина. Раствори­мый пектин определяют пектатным методом. В остатке опреде­ляют протопектин.

170

Промытый плотный остаток количественно переносят в кони­ческую колбу с 50 с\Г раствора соляной кислоты молярной кон­центрацией 0.3 моль/лм-\ Колб>" соединяют с обратным холодиль­ником и нагревают в течение 30 мин на водяной бане при темпе­ратуре кипения. Гидролизат центрифугируют, плотнею часть про­мывают горячей водой. Центрифугат и промывные воды собирают в мерную колбу вместимостью 500 см³.

Твердый остаток вместе с фильтром количественно перено­сят в коническую колбу и заливают 50—70 см³ цитрата аммония массовой долей 10 % и помещают на 30 мин в водяную баню при температуре кипения. Фильтруют в ту же мерную колбу (вместимостью 500 см³), осадок промывают горячей водой и охлаждают. Содержимое колбы доводят водой до метки. Полу­ченная вытяжка содержит протопектин и используется для ко­личественного анализа.

Порядок проведения анализа. В колбу Эрленмейера или хими­ческий стакан вместимостью 500 см³ отмеряют пипеткой Мора 25 см³ фильтрата и приливают 100 см³ раствора NaOH молярной концентрацией 0,1 моль/дм³, оставляют на 30 мин. За это время происходит омыление растворимого пектина, который перехо­дит в натриевую соль пектиновой кислоты. Затем добавляют 50 см³ раствора уксусной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм³ и получают свободную пектиновую (полигалактуро- новую) кислоту.

К полученной таким образом пектиновой кислоте через 5 мин прибавляют 50 см³ раствора хлорида кальция молярной концентрацией 2 моль/дм³ и оставляют на 1 ч. За это время вы­падает осадок пектата кальция. Осадок промывают горячей во­дой на взвешенном фильтре до тех пор, пока не исчезнет реак­ция на хлор с каплей раствора AgN0₃. Осадок вместе с фильт­ром помещают в бюкс и доводят до постоянной массы в су­шильном шкафу при 100 °С.

При расчете массу осадка уменьшают на 8 %, т. е. вносят по­правку на содержание в нем кальция. Содержание пектиновой кислоты (%) вычисляют по формуле

X

аУ 92 т У,

(1.34)

где д —масса пектата кальция, г; V— объем водного гидролизата протопектина (начальный объем водной вытяжки), см³; 92 — коэффициент пересчета в процен­ты (с поправкой на содержание кальция в пектате); т — масса навески исследуе­мого растительного материала, г; V_x — объем фильтрата, взятого для омыления и осаждения в нем пектата кальция, см³.

Пример. Навеска моркови массой 50 г измельчена, перенесена в мерную колбу вместимостью 250 см³ и доведена водой до метки, т. е. получен объем V. Для определения взято 25 см³ фильтрата (объем К,). Масса пектата кальция после до­ведения до постоянной массы равна 0,0256 г.

171

Дли определения массовой доли пектина ('< 1 получении. ллпшл: iio.ic; лилию в формулу

0.25Ь 250-92 50 ■ 25

О.-Г

11

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕКТИНА ФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ПО РЕАКЦИИ С КАРБАЗОЛОМ

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор соляной кис­лоты молярной концентрацией 0,3 моль/дм³; раствор цитрата аммония массовой долей 1 %; раствор NaOH молярной кон­центрацией 0,05 моль/дм³; раствор HCI молярной концентра­цией 0,05 моль/дм³; концентрированная H₇S0₄; раствор карба- зола массовой долей 2 % в абсолютном этаноле; галакгуроно- вая кислота; ступка фарфоровая; колбы конические вместимос­тью 100—250 см³; мерные колбы вместимостью 25, 250, 500 см³; водяная баня; пробирки стеклянные; сосуды со льдом; спек­трофотометр.

Подготовка проб. Навеску свежего продукта (плодов, овощей) массой 10 г тщательно растирают со стеклом в ступке до однород­ной массы, переносят водой в коническую колбу или центрифуж­ные пробирки, добавляют около 100 см³ нагретой до 50 °С воды и оставляют на 30 мин на водяной бане (лучше энергично взбалты­вать в течение 15—20 мин, после чего центрифугировать), сливают жидкость через фильтр в мерную колбу вместимостью 250 см³. Ос­таток повторно заливают водой, промывают фильтр и полученный фильтрат доводят водой до метки. Получают вытяжку водораство­римых пектиновых веществ.

Остаток из центрифужных пробирок переносят раствором НС1 молярной концентрацией 0,3 моль/дм³ в коническую колбу вместимостью 50 см³, закрывают пробкой с обратным холодиль­ником и помещают на 10 мин в водяную баню при температуре кипения. После этого смесь фильтруют через складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 250 см³, остаток промывают не­сколькими порциями воды. Фильтр и осадок переносят в экс­тракционную колбу, заливают 50 см³ раствора цитрата аммония массовой долей 1 % и выдерживают 30 мин на водяной бане при температуре кипения. Затем все смывают водой в ту же мерную колбу, фильтрат охлаждают и доводят водой до метки. При этом получается вытяжка, которая содержит нерастворимый прото­пектин и пектиновую кислоту.

В дальнейшем оба раствора анализируют одинаково.

Порядок проведения анализа. Для метоксилирования отбирают по 10 см³ вытяжки в мерную колбу вместимостью 50 см³, добавля­

172

ют 1U см" раствора NaOH молярной концентрацией 0,05 моль/дм-' и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. после чего добавляют 10 см³ раствора НО молярной концентрацией 0,05 моль/дм³ и доводят водой до метки.

В три пробирки вместимостью 10 см³. помешенные в сосуды со льдом, отбирают по 0,5 см³ исследуемого экстракта и осторожно по каплям приливают 3 см³ концентрированной H₂S0₄ (не допуская пе­регрева смеси). Затем пробирки нагревают в течение 6 мин на водя­ной бане при температуре кипения и снова охлаждают льдом. В две пробирки добавляют по 0,1 см³ раствора карбазола массовой долей 2 % и все пробирки помещают на 10 мин в водяную баню при темпе­ратуре кипения. После охлаждения измеряют оптическую плотность растворов в кювете слоем 0,5—1,0 см при длине волны 535 нм.

Контролем служит проба без карбазола.

Содержание пектиновых веществ рассчитывают по калибро­вочному графику.

Построение калибровочного графика. Готовят стандартный раст­вор галактуроновой кислоты и используют для получения разве­дений, обеспечивающих концентрацию от 0,5 до 50 мкг/см³. За­тем проводят окрашивание каждого из разбавленных растворов в условиях, описанных в методе, измеряют оптическую плотность при длине волны 532 нм в кювете слоем 0,5—1,0 см и строят гра­фик D =/( с).

Полученные расчетные и экспериментальные данные рекомен- • дуется свести в таблицу:

Образец	Метод определения	Массовая доля молочной кислоты, %

Затем студенты должны самостоятельно сделать выводы и сформулировать заключение.

Лабораторная работа № 27 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

Цель работы. Приобрести практический навык определения целлюлозы в комбинированных мясных продуктах и растительных материалах.

Задачи. Выделить целлюлозу (клетчатку) из образцов и рассчи­тать массовое содержание целлюлозы.

Объекты исследования. Мясорастительные продукты или растения.

Методические указания. Массовую долю целлюлозы определя­ют термогравиметрическим методом в двух вариантах.

173

Первый i; ; них ( ва р и а н i .Л. П. Ермакова>основан па окислении и расширении ра ;.шчны\ вешесдв. com.ic твующпч клетчатке. об­работанных азопюи кисло'юй в ланоде и полным раствором ще­лочи. Отличаею! простотой, скоростью выполнения и достаточ­ной точностью.

Сущность Hiopoio (вариант И.С.Лурье) сосюит в удалении кислото- и щелочерастворимых веществ и количественном опре­делении остатка, который условно принимается за сырую клетчат­ку. Последняя содержит часть лигнина, гемицеллюлоз и пенто- заны. В этом методе на результат анализа влияют многие факто­ры, поэтому для получения воспроизводимых результатов следует строго придерживаться описания метода.

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В МОДИФИКАЦИИ А. И. ЕРМАКОВА

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор гидроксида нат­рия молярной концентрацией 0,1 моль/дм³; раствор уксусной кис­лоты молярной концентрацией 1 моль/дм³; раствор хлорида каль­ция молярной концентрацией 2 моль/дм³: смесь четырех объемов этанола с одним объемом азотной кислоты (относительной плот­ностью 1,4); эфир серный; раствор гидроксида натрия или калия массовой долей 1,25%.

Подготовка проб. При определении клетчатки в колбы вмести­мостью 200—300 см³ взвешивают по 1—3 г измельченного расти­тельного продукта. Массу навески изменяют в зависимости от со­держания в исследуемом материале целлюлозы. Если в раститель­ном продукте массовая доля клетчатки 10—20 %, то берут навеску от 1,5 до 2 г, 40—50 % — от 1 до 1,3 г, менее 10 % — от 2,5 до 3 г.

Порядок проведения анализа. К навеске добавляют по 50 см³ смеси этанола и азотной кислоты, колбы соединяют с обратным холодильником на резиновой пробке и помещают на водяную баню при температуре кипения на 1 ч. Колбы в воду не погружа­ют, кипение должно быть равномерным. По окончании нагрева­ния дают осесть осадку, раствор декантируют на стеклянный фильтр, на поверхность которого насыпают 1—2 см³ мелкого тол­ченого стекла и отсасывают. Фильтр вместе со стеклом перед фильтрованием предварительно просушивают. Жидкость декан­тируют очень осторожно, чтобы не взмутить осадка. К осадку, ос­тавшемуся в колбе, прибавляют еще 50 см³ смеси этанола с кисло­той и вновь нагревают в течение 30 мин. После вторичной де­кантации через тот же стеклянный фильтр осадок в колбе промы­вают маленькими порциями этанола (96 об.%). Затем к промытому осадку в колбе прибавляют 50 см³ гидроксида натрия массовой до­лей 1,25 % и смесь нагревают на плитке. Щелочной раствор вместе с осадком переносят на стеклянный фильтр, отсасывают и промы­

174

вают два раза по 10—15 см-¹ горячей дпстиллированнои полой и 1—2 раза этанолом (96o6.fr). Стеклянный фильтр с чистой белой клетчаткой сушат ло постоянной массы при 105 °С (обычно в тече­ние 2 ч). Для ускорения сушки осадок после промывания этано­лом рекомендуется промыть еше серным эфиром.

Массовую долю целлюлозы определяют по формуле

т

где пи — масса сухого фильтра со стеклом и осадком целлюлозы, г; /;/₀ — масса су­хого фильтра со стеклом, г: т — масса навески объекта исследования, г.

Фильтрование следует вести в горячем состоянии, иначе об­разуются очень вязкие растворы. При замедлении фильтрова­ния перемешивают стеклянный слой, который снимает с филь­тровальной пластинки труднопроницаемый слой. Необходимо предотвращать просасывание воздуха через осадок, поэтому на фильтре всегда должен быть слой жидкости. Как только вся жид­кость прошла через фильтр, отсасывание тотчас же прекраща­ют. С целвю наиболее полного удаления лигнина при обработ­ке навески исследуемого материала к азотной кислоте добавляют раствор уксусной кислоты массовой долей 80 % и кристалличес­кую трихлоруксусную кислоту.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В МОДИФИКАЦИИ И. С.ЛУРЬЕ

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор серной кис­лоты массовой долей 1,25%; раствор гидроксида натрия или калия массовой долей 5 %; раствор соляной кислоты массовой долей 10 %; этанол ректификованный; эфир этиловый; стек­лянные пипетки; водяная баня; фильтры бумажные; колбы Эр- ленмейера; стаканы; электрическая плита; водоструйный насос; стеклянная воронка.

Подготовка проб. При определении массовой доли сырой клет­чатки навеску растительного препарата массой 2—3 г берут с точ­ностью ±0,01 г и помещают в стакан вместимостью 500 см³, на ко­тором отмечен уровень 200 см³.

Порядок проведения анализа. В стакан с пробой помеща­ют 200 см³ раствора серной кислоты массовой долей 1,25 %, ста­вят на плитку и содержимое доводят до кипения. Суспензию кипятят при постоянном перемешивании стеклянной палочкой в течение 30 мин. По мере выкипания жидкости уровень в ста­кане поддерживают приблизительно постоянным, периодичес­ки добавляя кипящую дистиллированную воду. Затем суспензии

175

лают отстояться. Далее, собрав чстановку (рис. 1.41). с помощью водоструйного насоса отсасыва­ют еще горячую жидкость.

Стеклянную воронку 6 ди­аметром около 5 см обтягивают шелковой сеткой 7и наклеивают на нее смоченный в горячей воде кружок фильтровальной бумаги, равный диаметру воронки. Изо­гнутой стеклянной трубкой 4 и толстостенной резиновой труб­кой 5 воронку соединяют с кол­бой 3 для фильтрования, кото­рую, в свою очередь, присоеди­няют к водоструйному насосу 1 толстостенной резиновой труб­кой 2. Как только фильтр плотно пристанет к шелковой сетке, во­ронку переворачивают фильт­ром вниз и осторожно вводят в стакан до соприкосновения с поверхностью горячей жидкости. Жид­кость отсасывают до тех пор, пока ее высота над осадком не будет равна примерно 10 мм. После этого пинцетом снимают фильтр с во­ронки, переносят его на внутреннюю стенку стакана и струей горя­чей дистиллированной воды промывают фильтр и стенки стакана от приставших к ним частиц осадка. Удалив из стакана промытый фильтр, в стакан до метки наливают горячую дистиллированную воду, размешивают в ней осадок, дают отстояться и отсасывают воду через фильтр еще раз. Операцию отмывания горячей дистиллирован­ной водой повторяют еще три раза, каждый раз меняя фильтр.

В стакан с промытым осадком отмеривают 50 см³ раствора гид­роксида натрия или калия массовой долей 5 %, доливают кипящей дистиллированной водой до метки и кипятят в течение 30 мин. За­тем жидкость над осадком отсасывают и промывают еще два раза дистиллированной водой. После последнего отсасывания воды оса­док переносят с помощью дистиллированной воды, подкисленной 2—3 каплями раствора соляной кислоты, на высушенный при темпе­ратуре 100—105 °С и взвешенный фильтр. Осадок на фильтре промы­вают последовательно дистиллированной водой, этанолом и эфиром до тех пор, пока фильтрат не станет бесцветным. Фильтр с осадком высушивают в предварительно взвешенном бюксе в сушильном шка­фу при температуре 100—105 °С до постоянной массы.

Массовую долю целлюлозы — клетчатки (%) рассчитывают по формуле

К = т_х ■ 100/ш, (1.36)

где /77, — масса остатка на фильтре, г; т — масса навески объекта исследования, г.

Рис. 1.41. Установка для определения массовой доли клетчатки

176

Полученные экспериментальные и расчеiные данные рекомен­дуется представить в виде таблицы:

Образец

ИеТЮЛЬ jYeMblii Метод i Массовая .кля целлюлозы. ^Сс

Затем студентам необходимо самостоятельно сформулировать выводы и сделать общие заключения по работе.

Лабораторная работа № 28

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Цель работы. Приобрести практический навык и освоить методы определения фосфорорганических соединений в мы­шечной ткани.

Задачи. Экстрагировать и определить массовую долю фосфор- органических соединений в анализируемых образцах на основа­нии фотометрических методов.

Объекты исследования. Образцы мышечной ткани разных ви­дов животных аналогичных анатомических участков на разных стадиях автолиза.

Методические указания. После убоя животного в мышечной ткани под воздействием ферментов органические фосфаты рас­падаются, в связи с чем уменьшается содержание органического фосфора и увеличивается количество более простых азотистых продуктов и неорганических фосфатов.

Фосфорорганические соединения входят в группу экстрактив­ных веществ и в технологии мясных продуктов являются пищевы­ми добавками, отвечающими за вкус. Важнейшими из них явля­ются креатин, креатинфосфат и креатинин:

он

/

nh2	nh—р=0 I \ 1 он c=nh i	nh
c=nh		c=nh
n-ch3	1 n—сн-, i	n-ch3
сн2	1 сн2	сн, 1
соон	соон	1 со
Креатин	Креатин­фосфат	Креатинин

177

К группе фосфооорганпческпч соединении ошосяюя щкже АТФ и ее производные: ,ЛДФ. АМФ.

Принципы методов определения фосфорсодержащих органи­ческих соединений основаны на способности неорганического фосфата давать цветные реакции.

Модифицированный колориметрически и метод Фиске —Су- барроу применяется при определении АТФ. креатининфосфата и других соединений.

Метод основан на измерении нарастания массовой концентра­ции неорганического фосфора в безбелковом фильтрате после кислотного гидролиза.

Неорганический фосфор определяют колориметрически. Суть метода состоит в том, что при обработке раствора, содержащего фосфор, молибдатом аммония в кислой среде образуется фосфор- номолибденовая кислота Н₇[Р(Мо-,0₇)₆].

Н₃Р0₄ + 12(NH₄)Mo0₄^> H₇[P(Mo₂0₇)₆| + (NH₄)₂S0₄ + Н₂0.

При взаимодействии с восстановителем фосфорномолибдено- вая кислота образует смесь комплексов, содержащих молибден в различных валентностях. Смесь растворима в воде и называется молибденовой синью.

Интенсивность синей окраски пропорциональна концентрации фосфора в растворе и может быть измерена фогоколориметрически.

Модификации метода связаны с применением различных вос­становителей (амидола, аскорбиновой кислоты и др.) при соответ­ствующей кислотности среды.

Приготовление реактивов. Раствор эйконогена массо­вой долей 0,25 % в 100 см³ воды растворяют 15 г NaHC0₃, 0,5 г Na₂C0₃ и 0,25 г эйконогена. Раствор фильтруют, перед использо­ванием разбавляют в 4 раза дистиллированной водой.

Подготовка проб. Образцы мышечной ткани помещают на 15— 20 мин в охлажденных металлических чашках в морозильную ка­меру холодильника, регулятор которого за 20—30 мин до начала опыта устанавливают на максимальный холод.

Из замороженной ткани готовят навески массой (1,0000 + ± 0,0002) г и быстро растирают в предварительно охлажденных фарфоровых ступках с охлажденным кварцевым песком в соотно­шении 1 : 1 (по массе). Гомогенат используют для определения АТФ и креатинфосфата.

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ АТФ

Материалы, реактивы и оборудование. Фарфоровая ступка с пес­тиком или гомогенизатор; кварцевый песок; штатив; пробирки центрифужные и мерные вместимостью 10 см³; настольная цент­

178

рифуга: полянам баня: фотоэлекгроколоримеф: раствор ipnx.iop- уксусной кислоты (ТХУ) массовой долей 10 ^гс; растворы ацетата ртути массовой долей 0.5 и 20 ^сс: растворы соляной кислоты мо­лярной концентрацией 0.1 и 2.0 моль/дм³; спиртовые растворы фенолфталеина массовой долей 0.5 и 1 °с\ раствор молибдата ам­мония массовой долей 2.5 % в растворе серной кислоты моляр­ной концентрацией 2.5 и 5 моль/см³; раствор аскорбиновой кис­лоты массовой долей 0,1 %.

Порядок проведения анализа. Подготовленный образец помеща­ют в мерную пробирку, доводят объем раствором трихлоруксусной кислоты массовой долей 10 % до метки, перемешивают, выдержи­вают 30 мин при (20 ± 5) °С и фильтруют через бумажный фильтр. В центрифужную пробирку помещают 2 см³ фильтрата, добавляют 0,5 см³ раствора ацетата ртути массовой долей 20 %, тщательно пе­ремешивают и через 15 мин центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 50 с^-1.

Надосадочную жидкость осторожно сливают, а осадок дваж­ды промывают, добавляя по 2 cm^j раствора ацетата ртути массо­вой долей 0,5 %. Полученный осадок растворяют в 1 см³ раство­ра соляной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм³, до­водят дистиллированной водой до объема 3 см³ и тщательно пе­ремешивают.

По 1 см³ полученной смеси помещают в две мерные пробирки вместимостью 10 см³. Первую пробирку используют для опреде­ления легкогидролизуемой фракции фосфора (ЛГФ), вторую — для определения неорганического фосфора (НФ). В первую про­бирку добавляют 1 см³ раствора соляной кислоты молярной кон­центрацией 2 моль/дм³ и нагревают на водяной бане при темпе­ратуре кипения в течение 7 мин, охлаждают, добавляют каплю фенолфталеина и нейтрализуют раствором гидроксида натрия молярной концентрацией 5 моль/дм³ до появления едва заметно­го розового окрашивания.

В обе пробирки вносят по 1,2 см³ раствора молибдата аммония массовой долей 2,5 % в растворе серной кислоты молярной кон­центрацией 2,5 моль/дм³ и по 1 см³ раствора аскорбиновой кисло­ты массовой долей 0,1 % (в методе Фиске—Субарроу в качестве восстановителя применяется 1-амино-2-нафтол-4-сульфоновая кис­лота или эйконоген), доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Через 20 мин содержимое каждой пробирки коло- риметрируют в фотоэлектроколориметре против каждой из конт­рольных проб при красном светофильтре (А,= 670нм). Получен­ные значения оптической плотности фиксируют. Для расчета ис­пользуют значения оптической плотности, соответствующие ди­апазону наибольшей чувствительности шкалы прибора. Коли­чество АТФ определяют по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Готовят стандартный раствор однозамещенного фосфата калия, 1 см³ которого содер-

179

лит 0,025 mi фосфора (0.1099 г КН,Р(>₄ помешают в мерную колбу вместимостью 1 дм' и доводят объем дистиллированной водой до метки). В каждую из трех мерных пробирок вместимостью 10 см' пометают 0,5: 1,0 и 2,0 см³ стандартного раствора КН₇Р0₄ и про­водят те же реакции, что и для исследуемых проб. После развития специфического окрашивания растворы колориметрируют и стро­ят график зависимости оптической плотности от концентрации неорганического фосфора.

Массовую долю АТФ (мг%) рассчитывают по формуле

Х= тЕ_мфаУ,У_{)/{Е_нфтУ₂У_ъ), (1.37)

где 10 — коэффициент пересчета в мг%; £_ПГф и £"_НФ — эксгинкции проб при опре­делении фракций соответственно легкогйдролизуемого и неорганического фос­фора; а — масса фосфора в 10 см³ стандартного раствора, мкг; V_{) — объем исследу­емого раствора, см³; V_(] — 10 см³; V_{ — объем исследуемого раствора после раство­рения осадка, см³; V_] = 3 см³; т — масса навески мышечной ткани, г; К, — объем исследуемого раствора, взятого для осаждения АТФ, см³; К₂ = 2см³; ^ — объем исследуемого раствора, взятый для колориметрирования, см³; К= 1 см³.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ КРЕАТИНФОСФАТА

Материалы, реактивы и оборудование. Раствор ацетата ртути мас­совой долей 25 % в растворе уксусной кислоты массовой долей 2 %; раствор ТХУ массовой долей 6 %; раствор NH₄OH массовой долей 10%; стандартный раствор КН₂Р0₄, содержащий 2 мг фосфора в

1 см³ раствора (перед использованием разбавляют дистиллирован­ной водой в 100 раз); раствор эйконогена массовой долей 0,25%. Материалы и оборудование см. в п. 1 настоящей работы.

Порядок проведения анализа. В центрифужную пробирку поме­щают 2 см³ раствора ацетата ртути массовой долей 25 %, приготов­ленного на растворе уксусной кислоты массовой долей 2 %, и ох­лаждают ледяной смесью или в холодильнике.

К гомогенату мышечной ткани в охлажденной ступке добавля­ют 20 см³ охлажденного раствора ТХУ массовой долей 6 %, содер­жимое ступки перемешивают и выдерживают 5—7 мин.

Раствор фильтруют в предварительно охлажденные пробирки,

2 см³ прозрачного фильтрата переносят в подготовленную центри­фужную пробирку с охлажденным раствором ацетата ртути, добав­ляют 1—2 капли раствора фенолфталеина и содержимое пробирки нейтрализуют раствором NH₄OH массовой долей 10 % до появле­ния слабого розового окрашивания, избегая добавления избытка аммиака. Пробирку оставляют на 15 мин в ледяной смеси (или хо­лодильнике), периодически помешивая содержимое стеклянной палочкой, которую не вынимают из пробирки.

Параллельно готовят контрольную пробу, в которой вместо трихлоруксусного фильтрата используют 2 см³ раствора ТХУ мас­совой долей 6 %.

180

Через 15 мин содержимое опытной и кошродьноп пробирок цен­трифугируют при частоте вращения 50 с ¹ в течение 20 мин.

Надосадочную жидкость переносят в мерные колбы вмес­тимостью 50 см³ и используют для определения креатинфос­фата. В мерную колбу с надосадочной жидкостью из конт­рольной пробирки вносят 2 см³ стандартного раствора КН₂Р0₄. Затем в обе колбы (опыт и контроль) одновременно добавляют по 2 см³ раствора молибдата аммония массовой долей 2,5 %, приготовленного на^ растворе серной кислоты концентрацией 5 моль/дм³, и 0,5 см³ раствора эйконогена (1-амино-2-нафтол- сульфоновой кислоты).

Содержимое колб доводят дистиллированной водой до метки и через 30 мин фотоколориметрируют с красным светофильтром при X — 670 нм против дистиллированной воды.

Массовую долю креатинфосфата (мг%) определяют по формуле

X = (D_Kb-\00-20)/(D_onm-2), (1.38)

где D_K и D_on — оптическая плотность соответственно контрольной и опытной проб; b — масса неорганического фосфора в 2 см³ стандартного раствора, мг; Ь~ 0,04 мг; 100 — коэффициент для пересчета в мг%; 20 — объем раствора ТХУ. см³; /w — масса исходной навески мышечной ткани, мг; 2 — объем фильтрата, взя­тый для исследования, см³.

После измерения оптической плотности окрашенных раство­ров фосфорорганических соединений выполняют расчеты, а ре­зультаты оформляют в виде таблицы. Самостоятельно формулиру­ют выводы и общие замечания по работе.

Образец	Массовая доля в мышечной ткани, мг%		Выводы
	АТФ	креатинфосфата

Лабораторная работа N2 29

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ В МЯСЕ И МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ

Цель работы. Приобрести навык в освоении экспресс- и арбит­ражного методов определения массовой доли влаги в мясе и мяс­ных продуктах

Задачи. Определить массовую долю влаги в мясе и мясных про­дуктах термогравиметрическим методом.

Объекты исследования. Мясо и мясные продукты различных ассортиментных групп, включая копченые, варено-копченые, ва­реные, фаршированные колбасы, мясные хлеба, сосиски, сардель­

181

ки. продукты из свинины, баранины, говядины, мяса ппшы. других видов скота, зедвпы. студни, паштеты. фаршевые кон­сервы и т. д.

Материалы, реактивы и оборудование. Этанол: электрическая мясорубка с диаметром отверстий решетки от 3 до 4 мм; шкаф сушильный электрический с терморегулятором: сушильный ап­парат САЛ; весы лабораторные: баня водяная: стаканчики для взвешивания (бюксы) или бюксы металлические диаметром 50 мм и высотой 25—35 мм: эксикатор; палочки стеклянные: предварительно обработанный песок речной или кварцевый; ус­тройство Я 10-ФВУ.

Методические указания. Влажность продуктов — весьма важ­ный показатель при оценке качества мясных продуктов, который влияет на сохранность, выход, консистенцию и другие техноло­гические характеристики. В аналитической практике применяют­ся различные методы и их модификации, в основе которых лежит гравиметрическое определение.

Приготовление песка. Песок просеивают сначала через сито с диаметром отверстий 1,5 мм, а затем через сито с диаметром от­верстий 0,3 мм, промывают водопроводной водой до тех пор, пока вода перестанет мутнеть. Затем песок заливают двойным объемом разбавленной (1:1) соляной кислоты и выдерживают в течение суток, периодически перемешивая. После обработки кислотой пе­сок промывают водой до нейтральной реакции промывных вод на лакмус, высушивают при 150—160 °С до постоянной массы и хра­нят в закрытой склянке.

Подготовка проб. Пробы продуктов освобождают от оболочек и измельчают.

Пробы колбасных изделий, вареных, варено-копченых, коп- чено-запеченных, запеченных и жареных продуктов, фарше- вых консервов, а также соленого бекона два раза измельчают на бытовой или электрической мясорубке и тщательно пере­мешивают.

Пробы сырокопченых колбас дважды измельчают на электри­ческой мясорубке или нарезают острым ножом на круглые ломти­ки толщиной не более 1 мм, после чего их режут на полоски и ру­бят ножом так, чтобы размер частиц пробы не превышал 1 мм, все тщательно перемешивают.

Пробы паштетов, студней и зельцев измельчают на быто­вой или электрической мясорубке один раз и тщательно пе­ремешивают.

Подготовленную пробу помещают в стеклянную банку с притертой пробкой вместимостью 200—400 см³, заполнив ее полностью, и хранят при температуре от 3 до 5 °С в те­чение 24 ч.

182

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ (103 ±2) С

Порядок проведения анализа. В бюкс гюмсшаюг песок в коли­честве. примерно в 2—3 раза превышающем навеску продукта, стеклянную палочку длиной немного большей диаметра бюкса (чтобы она не мешала закрыть бюкс крышкой) и высушивают в сушильном шкафу в открытом бюксе при температуре (ЮЗ ± 2) °С в течение 30 мин. Затем бюкс закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе до комнатной температуры и взвешивают. Во взве­шенный бюкс с песком вносят навеску продукта массой Зги повторно взвешивают. К содержимому приливают 5 см³ этанола и перемешивают стеклянной палочкой.

Помещают бюкс на водяную баню (80—90 °С) и, помешивая палочкой, нагревают до исчезновения запаха этанола. Затем пробу высушивают в течение 2 ч в сушильном шкафу при температуре (103 ± 2) °С, охлаждают в эксикаторе и взвешивают.

Высушивание продолжают до постоянной массы. Каждое по­вторное взвешивание проводят после высушивания в течение 1ч при температуре (103±2)°С. Результаты двух последова­тельных взвешиваний не должны отличаться более чем на 0,1 % массы навески. Взвешивание проводят на весах с погрешностью не более ± 0,001 г. Массовую долю влаги рассчитывают по раз­нице массы проб:

Х =

f т_] — т₂ ^ т, — т

•100,

и

v ¹ у

(1.39)

где т_{, т₂ — масса бюкса с песком, стеклянной палочкой и навеской соответ­ственно до и после высушивания, г; т — масса бюкса с песком и стеклянной па­лочкой после высушивания, г.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ (150 + 2) °С

Порядок проведения анализа. В бюкс помещают песок в коли­честве, примерно в 2—3 раза превышающем навеску продукта, стеклянную палочку и высушивают в сушильном шкафу при тем­пературе (150±2)°С в течение 30 мин. Затем бюкс закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе до комнатной температуры и взвешивают. Далее в бюкс с песком вносят навеску продукта 3 г, взвешивают повторно, тщательно перемешивают с песком стек­лянной палочкой и высушивают в сушильном шкафу в открытом бюксе при температуре (150 ± 2) °С в течение 1 ч. Затем бюкс за­крывают крышкой, охлаждают в эксикаторе до комнатной темпе­ратуры и взвешивают. Взвешивание проводят на весах с погреш­ностью не более 0,0002 г.

183

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ В АППАРАТЕ САЛ

Порядок проведения анализа. Перед началом работы сушиль­ный аппарат САЛ прогревают в течение 10—15 мин при напря­жении 150—200 В. После прогрева ламп устанавливают напря­жение 100—105 В. что обеспечивает температуру в зоне сушки 135-140 °С.

В бюкс помещают песок в количестве, примерно в 2—3 раза превышающем навеску продукта, стеклянную палочку длиной не­сколько большей диаметра бюкса (чтобы она не мешала закрыть бюкс крышкой) и высушивают в сушильном аппарате САЛ при температуре 135—140 °С в течение 10 мин. Затем бюкс закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе до комнатной температуры и взвешивают. Во взвешенный бюкс с песком вносят навеску про­дукта 2 г, повторно взвешивают и перемешивают стеклянной па­лочкой. Затем бюкс помещают в аппарат САЛ и высушивают при температуре 135—140 °С в течение 20 мин, охлаждают в эксикато­ре и взвешивают. Взвешивание проводят на весах с погрешностью не более ± 0,0002 г.

Расчет ведут по формуле (1.39).

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ В УСТРОЙСТВЕ Я10-ФВУ

Порядок проведения анализа. Во взвешенный со стеклянной па­лочкой бюкс вносят навеску продукта массой от 1,8 до 2,2 г, до­бавляют от 1,8 до 2,2 см³ дистиллированной воды, тщательно пе­ремешивают стеклянной палочкой, равномерно распределяя со­держимое по дну бюкса. Открытый бюкс с пробой устанавливают в держателе 10 блока высушивания 8 устройства Я10-ФВУ (рис. 1.42) и высушивают 16—18 мин при температуре (163 ± 2) °С и скорости движения воздуха (3,6 ±0,1) м/с. Затем бюкс извлека­ют из блока высушивания, закрывают крышкой, помещают в одну из секций блока охлаждения 12, охлаждают в потоке воздуха ком­натной температуры в течение 5—7 мин при скорости движения воздуха (5 ± 1) м/с и взвешивают. Результаты фиксируют с точнос­тью до четвертого десятичного знака.

Массовую долю влаги (%) вычисляют по формуле

у _ (^т\ ~ ⁿh)' ЮО

^х ' (1.40)

где /«1 — масса бюкса с песком, палочкой и навеской до высушивания, г; т₂ — масса бюкса с песком, палочкой и навеской после высушивания, г; /я₀ — мас­са бюкса с песком и палочкой, г.

184

Рис. 1.42. Общий вид (а) и устройство аппарата Я10-ФВУ (б):

/ — таймер: 2 — сигнальная лампа: 3, 6. 7—тумблеры вентилятора и регуляторов температуры и электрической сети; 4, 5—регуляторы вентилятора и температуры; 8 — блок высушивания; 9 — нагреватель; 10 — держатель бюкса в блоке высушивания; 77 —бюкс; 72—блок охлажде­ния; 13— вентиляторы; 14— изолирующая перегородка; 15— диффузор

За окончательный результат принимают среднее арифметичес­кое двух параллельных определений.

Расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 0,5 %. Окончательный результат вычисляют с точностью до 0,1 %.

Экспериментальные данные оформляют в виде таблицы, анализируют полученные результаты и формулируют заключе­ние по работе.

Образец, источник получения	Способ и условия определе­ния показателя	Массовая доля влаги, %

Лабораторная работа № 30 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ВОДЫ

Цель работы. Освоить метод определения активности воды (а_ы) в мясе и мясных продуктах.

Задачи. Закрепить представления о роли воды как важнейшего компонента биосистем мяса и мясопродуктов; экспериментально определить величину показателя а_ш для разных образцов мясного сырья, вторичных продуктов убоя, мясных продуктов.

185

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ В АППАРАТЕ САЛ

Порядок проведения анализа. Перед началом работы сушиль­ный аппарат САЛ прогревают в течение 10—15 мин при напря­жении 150—200 В. После прогрева ламп устанавливают напря­жение 100—105 В. что обеспечивает температуру в зоне сушки 135-140 °С.

В бюкс помещают песок в количестве, примерно в 2—3 раза превышающем навеску продукта, стеклянную палочку длиной не­сколько большей диаметра бюкса (чтобы она не мешала закрыть бюкс крышкой) и высушивают в сушильном аппарате САЛ при температуре 135—140 °С в течение 10 мин. Затем бюкс закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе до комнатной температуры и взвешивают. Во взвешенный бюкс с песком вносят навеску про­дукта 2 г, повторно взвешивают и перемешивают стеклянной па­лочкой. Затем бюкс помещают в аппарат САЛ и высушивают при температуре 135—140 °С в течение 20 мин, охлаждают в эксикато­ре и взвешивают. Взвешивание проводят на весах с погрешностью не более ± 0,0002 г.

Расчет ведут по формуле (1.39).

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ В УСТРОЙСТВЕ Я10-ФВУ

Порядок проведения анализа. Во взвешенный со стеклянной па­лочкой бюкс вносят навеску продукта массой от 1,8 до 2,2 г, до­бавляют от 1,8 до 2,2 см³ дистиллированной воды, тщательно пе­ремешивают стеклянной палочкой, равномерно распределяя со­держимое по дну бюкса. Открытый бюкс с пробой устанавливают в держателе 10 блока высушивания 8 устройства Я10-ФВУ (рис. 1.42) и высушивают 16—18 мин при температуре (163 ± 2) °С и скорости движения воздуха (3,6 ±0,1) м/с. Затем бюкс извлека­ют из блока высушивания, закрывают крышкой, помещают в одну из секций блока охлаждения 12, охлаждают в потоке воздуха ком­натной температуры в течение 5—7 мин при скорости движения воздуха (5 ± 1) м/с и взвешивают. Результаты фиксируют с точнос­тью до четвертого десятичного знака.

Массовую долю влаги (%) вычисляют по формуле

у _ (^т\ ~ ^тг)' ЮО

^х ' (1.40)

где /«1 — масса бюкса с песком, палочкой и навеской до высушивания, г; т₂ — масса бюкса с песком, палочкой и навеской после высушивания, г; /я₀ — мас­са бюкса с песком и палочкой, г.

188

Рис. 1.42. Общий вид (а) и устройство аппарата Я10-ФВУ (б):

/ — таймер: 2—сигнальная лампа: 3, 6. 7—тумблеры вентилятора и регуляторов температуры и электрической сети; 4, 5—регуляторы вентилятора и температуры; 8 — блок высушивания; 9 — нагреватель; 10 — держатель бюкса в блоке высушивания; 77 —бюкс; 72—блок охлажде­ния; 13— вентиляторы; 14— изолирующая перегородка; 15— диффузор

За окончательный результат принимают среднее арифметичес­кое двух параллельных определений.

Расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 0,5 %. Окончательный результат вычисляют с точностью до 0,1 %.

Экспериментальные данные оформляют в виде таблицы, анализируют полученные результаты и формулируют заключе­ние по работе.

Образец, источник получения	Способ и условия определе­ния показателя	Массовая доля влаги, %

Лабораторная работа № 30 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ВОДЫ

Цель работы. Освоить метод определения активности воды (а_ы) в мясе и мясных продуктах.

Задачи. Закрепить представления о роли воды как важнейшего компонента биосистем мяса и мясопродуктов; экспериментально определить величину показателя а_ш для разных образцов мясного сырья, вторичных продуктов убоя, мясных продуктов.

189

Сравнивают полученные результаты лля различных видов мясных продуктов, самостоятельно формулируют выводы и за­ключение по работе.

Контрольные вопросы и задания

1. В чем состоят биологические функции белкой'.'

2. Какова технологическая функциональность белков в производстве мясных продуктов?

3. Как разделяют белки мяса и мясопродуктов по морфологическому признаку клеток животных тканей?

4. Охарактеризуйте фракционный состав белков мышц.

5. Какие белки мышечной ткани относятся к водорастворимым, солераствори- мым, щелочерастворимым?

6. Каковы физико-химические свойства и структурные признаки белков раз­личных фракций? Чем обусловлены их прижизненные функции и каково их пи­щевое значение?

7. Какие функции выполняют миофибриллярные белки?

8. Какова роль соединительнотканных белков в рационах?

9. Как можно разделить основные белковые фракции мышечной ткани?

10. Какие гистидинсодержащие дипептиды являются специфической состав­ной частью скелетной мускулатуры? В чем заключаются их технологическое зна­чение и влияние на пищевую ценность мяса и мясопродуктов?

11. Каков морфологический и химический состав крови?

12. Дайте биохимическую характеристику крови.

13. Какое пищевое значение имеет кровь?

14. Дайте характеристику гемоглобина.

15. Каким способом можно выделить гемоглобин из крови?

16. Какие методы определения белков применяют в аналитической практике? Дайте их сравнительную оценку, укажите преимущества и недостатки.

17. Перечислите хроматографические методы определения белков и белко­вых веществ.

18. В чем сущность анализа белков методами гель-хроматографии, ионо­обменной хроматографии, хроматографии на бумаге, тонкослойной хромато­графии?

19. Какими методами можно определить свободные аминокислоты и связан­ные в структуре белков и пептидов?

20. Каковы особенности подготовки проб для количественного определения аминокислот?

21. Каковы биологические функции липидов?

22. Охарактеризуйте методы практического определения суммарных липидов в животных тканях.

23. В чем состоит принцип определения суммарных липидов методом Сокслета?

24. Какова химическая природа холестерина? Ответ подтвердите структурной формулой, уравнениями реакций.

25. В чем состоит сущность определения холестерина в животных тканях?

26. Перечислите качественные реакции, характерные для холестерина.

27. Охарактеризуйте физиологические функции стеролов (на примере холе­стерина).

28. Почему необходимо контролировать содержание холестерина в ра­ционах?

29. Каковы прижизненные функции и технологическое значение гликогена и продуктов его распада?

30. На чем основаны методы качественного и количественного определения гликогена, молочной кислоты?

188

31. Назовите полисахариды, перспективные для применения в технологии мясных продуктов общего и специального назначения в качестве функциональ­ных и физиологически активных добавок.

32. Назовите важнейшие фосфорорганпческпе соединения животных тканей. Какова их роль при жизни и в послеубойный период?

33. Какими методами определяют фосфорорганпческпе соединения?

34. Перечислите и охарактеризуйте формы связи влаги в мясных продуктах.

35. Какими методами можно определить массовую долю влаги в мясе и мяс­ных продуктах?

36. Что такое показатель активности воды⁹

37. Как показатель активности воды можно использовать для прогнозирова­ния стабильности свойств мяса и мясных продуктов при хранении?