3.2.4. Этап секвенирования днк.

Секвенирование - это процесс определения последовательности нуклеотидов фрагмента ДНК. Чаще всего используют дидезокси-метод Сэнджера. За один цикл можно секвенировать фрагмент ДНК не более 500 п.о., поэтому ген амплифицируют в виде небольших перекрывающихся двуцепочечных участков, каждый из которых затем секвенируют отдельно. Для метода Сэнджера, как и для ПЦР, нужны праймеры, смесь нуклеотидов, ДНК-полимераза. Кроме того, в отличие от ПЦР, в реакционную смесь добавляют дидезоксинуклеотиды ( ddATP ddGTP ddCTP ddTTP), являющиеся терминаторами синтеза ДНК. Как только один такой ddNTP встроится в синтезируемую цепь, синтез этой цепи прекратится. Пробу ДНК, амплифицированную в ходе ПЦР, распределяют на четыре пробирки, денатурируют и в каждую пробирку добавляют по одному из типов терминаторов. Синтез ДНК в каждой пробирке будет идти до тех пор, пока в цепь по правилу комплементарности не встроится терминатор, при этом в каждой пробирке окажется смесь фрагментов ДНК разной длины. Например, если последовательность нуклеотидов в исследуемой цепи ДНК - 5’ CAGTA3’, то комплементарная ДНК (кДНК) должна состоять из последовательности 3’ GTCAT 5’, в пробирке №1 с ddATP синтезировались только фрагменты из ТА (тимин, аденин), в пробирке №2 с ddGTP – фрагмент TACTG, в пробирке № 3 с ddCTP – TAC, и в пробирке №4 с ddTTP получилась смесь из T и TAСT. Далее фрагменты из каждой пробирки с помощью электрофореза в денатурирующем ПАА-геле разделяют по длине. Ближе всего к старту останется фрагмент из 5 нуклеотидов из пробирки с дидезоксигуанином, чуть дальше от старта ушел фрагмент из 4 нуклеотидов из пробирки с дидезокситимином и т.д. Следовательно, переписав названия азотистых оснований в составе ddNTP каждой из этих пробирок, можно получить последовательность нуклеотидов в цепи, комплементарной исследуемой (в цепи кДНК).

В настоящее время процесс секвенирования автоматизирован. Информация о последовательностях ДНК хранится в компьютерных базах данных. И если к 1990 году весь объем секвенированных последовательностей не превышал 108 п.о., то к 2005 году были секвенированы все гены человека (3 млрд. 200 млн. о. в гаплоидном наборе) с учетом всех видов мутаций и полиморфных замен.

3.2.5.Этап анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (пдрф).

Для обнаружения конкретных генных мутаций проводят анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. Для этого используют бактериальные ферменты - рестриктазы (сайтспецифические эндодезоксирибонуклеазы), способные разрезать ДНК в определенных точках или сайтах на разные по размеру фрагменты.

Существует несколько сотен видов таких ферментов, причем каждый вид узнает на двуцепочечной ДНК (дцДНК) специфическую последовательность от 4 до 10 п.о. , называемую сайтом рестрикции .

С помощью метода ПДРФ анализируют определенный фрагмент ДНК, предположительно несущий какое-либо мутационное изменение, которое приводит к появлению нового или исчезновению прежнего сайта рестрикции ДНК. Исследуемые фрагменты ДНК после рестрикции будут иметь другие размеры и иную электрофоретическую картину. Если исходный нормальный фрагмент имел 3 сайта рестрикции, то после электрофореза можно увидеть четыре полосы, соответствующие четырем рестрикционным фрагментам ДНК разного размера. Появление дополнительного сайта рестрикции вследствие генной мутации приведет к появлению лишней пятой полосы на геле, соответствующей дополнительному рестрикционному фрагменту ДНК. Исчезновение естественного сайта приведет к исчезновению одной из полос.

С помощью рестрикционного анализа можно выявлять лиц, имеющих высокий риск развития онкологических заболеваний и являющихся гетерозиготными носителями мутантных генов-супрессоров опухолевого роста и других генов, контролирующих клеточный цикл .

Поиск полиморфных сайтов рестрикции проводят для досимптоматического выявления риска наследственной предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям, а также для геномной дактилоскопии при идентификации личности. При этом проводят сравнение электрофоретических картин рестрикционных фрагментов ДНК исследуемого образца с такими же картинами ближайших родственников (родителей, детей; сибсов, т.е. родных братьев и сестер). Как правило анализируется не одна точка , а несколько различных локусов (10-15 MLP). Наибольшее количество одинаковых полос после электрофореза указывает на самую большую степень родства между людьми.