Особливості імуноферментного аналізу
ІМУНОСОРБЕНТИ. У багатьох тест-системах на основі гетерогенного ІФА використовують імуносорбенти – тверда фаза - носій (найчастіше планшет) із нанесеними на неї антигенами або антитілами. Білки, що використовуються для приготування імуносорбенту, багато в чому визначають чутливість і специфічність аналізу, тому вони (АТ і АГ) повинні бути високого ступеня чистоти та активності, а АГ окрім того, мають високу антигенність.
Як антигени можна використовувати лізати очищених віріонів, бактерій, окремі фракції білків, виділені із клітин, де культивували інфекційний агент. Але на сьогодні як антигени для ІФА найчастіше використовують синтетичні пептиди та рекомбінантні білки. Їх використання має ряд переваг:
безпека під час роботи, оскільки, отримуючи антигени із вірусів
чи бактерій, персонал контактує з інфекційними агентами;
спрощення процедури очищення Аг;
підвищення чистоти АГ, а отже і специфічності тест-систем.
Технологія одержання рекомбінантних білків дозволяє отримувати досить очищений аналог будь-якого антигену.
Чутливість і специфічність ІФА підвищується при використанні моноклональних АТ і, незважаючи на ряд проблем при їх використанні (низька афінність АТ при використанні великих молекул білків, складність застосування в неконкурентному сендвіч-аналізі), це все ж таки дозволяє виявляти низькі концентрації аналізованих речовин.
ТВЕРДОФАЗНІ НОСІЇ. Важливим компонентом для проведення ІФА є тверда фаза або носії, на поверхні яких у деяких варіантах ІФА проходять реакції. Носії повинні відповідати ряду вимог, обумовлених специфікою методу; йдеться насамперед про:
нерозчинність носія в умовах проведення аналізу;
достатню сорбційну ємність (визначається кількістю імобілізованого білка на одиницю маси чи площі поверхні носія);
однорідність сорбційної ємності на всій поверхні носія, що гарантує відтворюваність результатів;
мінімальна здатність до неспецифічного зв’язування;
незворотне та міцне зв’язування білків з носієм.
Найчастіше як носії використовують синтетичні полімери – полістирол, поліпропілен, полівініл, декрил. Також можна використовувати целюлозу, сефарозу, сефадекс, силохром та ін.
Найбільш зручними для роботи є полістирольні мікропланшети на 96 лунок із пласким дном, оскільки вони дозволяють одночасно аналізувати велику кількість зразків, використовувати невелику кількість діагностичних препаратів, їх легко відмивати на всіх етапах роботи. Полістирол обов’язково має бути однорідним і прозорим, щоб це не впливало на показники оптичної густини проб.
Етап відмивання носія від надлишку компонентів є дуже важливим у більшості варіантах ІФА, так як потрібно не просто сполоснути фіксовані на твердому носієві компоненти, а видалити реагенти зі всієї глибини реакційного шару, що визначається також і умовами дифузії. Відмивання обов’язково проводяться на всіх стадіях ІФА, і це - один з найдовших етапів, який значною мірою визначає загальну тривалість аналізу. Існують різні способи прискорення даного процесу, наприклад використання шейкерів, накладання ультразвуку. Окрім планшетів перспективним є використання полімерних плівок з вкрапленням вуглецевих носіїв та нітроцелюлозних фільтрів.
Також можна використовувати носії у формі кульок, дисків, трубочок і т.і. Така форма носіїв збільшує поверхню і сорбційну ємність твердої фази і, тим самим, дещо підвищує чутливість ІФА. Насьогодні досить широко застосовуються магнітні часточки як носії, їх легко відокремлюють з застосуванням магнітного поля.
ІМОБІЛІЗАЦІЯ АНТИГЕНІВ ЧИ АНТИТІЛ НА ТВЕРДІЙ ФАЗІ.
Іммобілізація або зв’язування АГ чи АТ із твердою фазою (носієм) може відбуватися за рахунок «пасивної» адсорбції або ковалентних взаємодій між АГ чи АТ і твердою фазою.
У випадку «пасивної» адсорбції носій декілька годин інкубують з розчином відповідних АТ чи АГ, при цьому зв’язування матеріалу із поверхнею носія є неспецифічним і відбувається за рахунок гідрофобних взаємодій між неполярними групами білків АГ чи АТ і неполярними групами пластику чи полістиролу та за рахунок іонних і водневих зв’язків.
Після інкубації надлишок АТ чи АТ, що не зв’язалися, обов’язково видаляють; а носій, для попередження можливої неспецифічної адсорбції на ньому кон’югатів чи інших компонентів, обробляють так званим блокувальним розчином «інертних білків», що мають високу спорідненість до центрів сорбції носія. Це 1-3% альбуміном чи 0,05-0,1% желатином, що дозволяє заблокувати залишкові вільні центри зв’язування, з якими могли б неспецифічно взаємодіяти молекули кон’югату. Також можна використовувати неіонні детергенти. Широкого використання набуло сухе порошкове молоко (powdered milk).
При виборі «блокувального» розчину обов’язково потрібно враховувати можливість його зв’язування з досліджуваними антигенами. Наприклад, альбумін ефективно адсорбує естрадіол, зрозуміло, що це буде впливати на кінцеві результати.
Оскільки гідрофобні зв’язки нестабільні, для того, щоб попередити десорбцію АТ чи АГ із твердої фази, проводять їх ковалентне приєднання до носія. При цьому як носій можна використовувати латекс, нейлон, сефарозу і целюлозу, синтетичні полімери.
Для забезпечення ковалентних взаємодій між носієм і антигеном, чи антитілом, в пластмасу додають речовини, що приводить до появи в її складі хімічних радикалів, на яких і фіксується білок; або носій попередньо обробляють певними реагентами з метою активації реакційно здатних центрів, що дозволяє здійснювати наступне ковалентне зв’язування АГ чи АТ.
ФЕРМЕНТИ і СУБСТРАТИ. Сьогодні відомо більш ніж 2000 ферментів, однак тільки деякі використовуються в імуноферментному аналізі. Ми згадували, що висока чутливість імуноферментних методів пов’язана із каталітичними властивостями ферментів, що використовуються як мітки, коли одна молекула ферменту може реагувати із великою кількістю молекул субстрату. Ферменти, які використовують для мічення, повинні відповідати ряду вимог, зокрема:
мати високу специфічність та високу питому каталітичну активність, що дозволяє виявляти ферментну мітку в низьких концентраціях;
бути доступними для одержання;
зберігати високу ферментативну активність після хімічної модифікації при отриманні кон’югату із АТ чи АГ;
бути стабільними за оптимальних умов взаємодії АГ з АТ;
кількісно визначатися за допомогою простих та чутливих методів.
У відповідності до перерахованих вимог в ІФА найбільш широко використовуються лужна фосфатаза (ЛФ), пероксидаза хрону (ПХ) та бета-галактозидаза. При використанні усіх трьох ферментів концентрації продуктів ферментативної реакції визначаються на рівні пікомолей, тобто методи досить чутливі.
Субстрати. Оскільки фермент взаємодіє з субстратом специфічно, вибір субстрату залежить від вибору ферменту-мітки. Субстрат має :
забезпечувати чутливість методу при виявленні ферменту, що входить до кон’югату;
утворювати продукти реакції, що добре реєструються;
бути дешевим, доступним, безпечним.
Як ми вже згадували в ІФА найчастіше використовуються ферменти пероксидаза хрону, лужна фосфатаза, бета-галактозидаза. Всі три ферменти можуть використовувати хромогенні, флуоресцентні, люмінесцентні субстрати і, відповідно, метод детекції ферментативної активності може бути фотометричним, флуориметричним, хемілюмінісцентним. Найчастіше використовують хромогенні субстрати, які в результаті реакції утворюють забарвлені продукти. Отже, оцінку результатів ІФА можна проводити візуально, але це є не досить інформативно. Більш детальні результати отримують при інструментальній реєстрації оптичної густини. Для цього використовують фотометричні прилади – прості колориметри і спеціальні для ІФА автоматичні колориметри (моно- і мультискани, рідери), які вимірюють оптичну густину безпосередньо в лунках планшетів.
Пероксидаза хрону (ПХ) –КФ 1.11 – менш дорогий і більш доступний комерційний продукт. Англійською мовою пероксидаза хрону - Horseradish peroxidase (HRP).
ПХ – фермент з Мм 40 кДа, містить залізовмісну гем-групу, має 4 дисульфідні зв’язки та 2 молекули Са2+ на молекулу ферменту, належить до глікопротеїдів. Це дозволяє зв’язувати фермент з АТ за допомогою вуглеводневої частини молекули, що супроводжується незначною втратою ферментативної активності. Окрім того, продукти реакції мають забарвлення, що дозволяє проводити чітку візуальну ідентифікацію.
Пероксидаза хрону каталізує двохсубстратні реакції за участі перекису водню та хромогенного субстрату АН2 . Фермент характеризується широкою субстратною специфічністю щодо другого - хромогенного субстрату. При фотометричному визначенні активності пероксидази як субстрат використовують хромогени, які дають яскраво забарвлені продукти реакції під впливом атомарного кисню, що вивільняється ферментом з перекису водню. Зокрема орто-фенілен-діамін (ОФД) з безбарвного перетворюється на жовтий, а тетра-метил-бензидин (ТМБ)= англ. ТМВ- з безбарвного на синій колір. ТМБ є насьогодні більш популярним, оскільки ОФД- канцерогенний.
Після додавання стоп-реагенту оптичну густину продуктів реакції з використанням ТМВ визначають при 450 нм.