27

Імуноферментний аналіз (іфа)

Нагадаю :

Імунохімічні методи аналізу, які ґрунтуються на специфічному зв’язуванні аналізованої речовини (аналіту) відповідними антитілами можна розділити на чотири великі групи:

1. Прямі (безпосередні) методи визначення реакції антиген-антитіло. Комплекси, що при цьому утворюються ідентифікують або візуально або за допомогою простих оптичних приладів. До таких методів належать преципітація в розчині, гелі на полімерній плівці, аглютинація бактерій, аглютинація еритроцитів вірусами, антитілами.

2. Реакції пасивної аглютинації (тобто аглютинації частинок, з поверхнею яких зв’язані АТ чи АГ). Це методи пасивної і непрямої гемаглютинації, латексаглютинації, коаглютинації.

3. Індикаторні методи, засновані на використанні різних міток (ізотопних, флуоресцентних, парамагнітних, ферментних) для виявлення реакції антиген-антитіло. Це імуноферментний, імунофлуоресцентний, радіоімунологічний аналіз.

4. Метод імуносенсорів, генного зондування.

Метод імуноферментного аналізу (ІФА) було запропоновано на початку 70-х років трьома групами дослідників: Engvall і Perlmann в Швеції, van Weemen і Schuur в Нідерландах і Rubenstein з колегами в США. До кінця ХХ століття цей метод пройшов шлях від наукової розробки до рутинного методу клінічної діагностики. Сьогодні ІФА-діагностика є одним з найпоширеніших імунологічних методів клінічної діагностики, який використовується в міських і районних лікарнях, поліклініках, пологових будинках, закладах санепідемнагляду і ін. Методом ІФА проводиться індикація і кількісна оцінка біоорганічних сполук.

Більш ніж за 30 років існування імуноферментний аналіз (ІФА) став одним із провідних методів для якісного та кількісного визначення антигенів та антитіл і майже витіснив інші методи, що також грунтуються на реакції антиген-антитіло. На сьогодні ІФА широко використовується в різних галузях медицини, сільського господарства, біотехнології. Основним напрямком його використання є рання діагностика захворювань людини, тварин, рослин, проведення масових епідеміологічних обстежень, контроль якості продукції, що випускається медичною, мікробіологічною, харчовою промисловістю, контроль донорської крові, тести на наявність наркотиків, гормонів, контроль забруднення навколишнього середовища та ін.

ІФА набув такої популярності завдяки ряду беззаперечних переваг:

- можливість використання мінімальних об’ємів досліджуваних зразків;

- стабільність та доступність реагентів;

- простота та швидкість (від кількох хвилин до кількох годин) проведення реакцій;

- автоматизація майже всіх етапів ІФА;

- можливість одночасного проведення масових аналізів;

- відносно низька вартість діагностичних наборів;

- висока чутливість, специфічність та відтворюваність результатів.

Основною рисою, яка відрізняє ІФА від інших імунохімічних методів, є те, що як індикаторна молекула, що дозволяє слідкувати за утворенням імунних комплексів, використовується молекула ферменту. В зв’язку з тим, що ферменти можуть модифікувати не одну (як у звичайних ферментативних реакціях), а багато молекул субстрату (тобто мають підсилюючі властивості), чутливість імуноферментних методів може бути дуже високою. В літературі є дані щодо рекордних меж визначення речовин даним методом – до 10^-21 молів у зразку.

Отже принцип ІФА полягає у тому, що комплекс антиген-антитіло можна виявити, якщо ввести до складу одного із учасників імунної реакції (приєднати до АГ чи АТ) одну або декілька молекул ферменту. Причому ця процедура як на проміжних (під час приєднання), так і на кінцевій стадії (кон’югат антигену чи антитіла з ферментом) не повинна змінювати основних властивостей комплексу: АТ і АГ мають зберігати імунохімічну специфічність, а фермент – ферментативну активність.

Весь процес ІФА можна розділити на три основні стадії:

1. Детекція або розпізнавання аналізованої речовини за рахунок використання специфічних до неї АТ чи АГ та формування специфічного комплексу АГ-АТ.

2. Введення кон’югату ферменту з АГ чи АТ (ферментної мітки) та його зв’язування або із комплексом АГ-АТ або із вільними центрами зв’язування.

3. Візуалізація або трансформація ферментної мітки у відповідний сигнал, який можна виміряти за допомогою різних фізико-хімічних методів (спектрофотометричних, флуориметричних, люмінесцентних та ін). В основі візуалізації результатів лежить здатність ферменту розщеплювати субстрат.