Количественное определение ферментативной активности

В отличие от низкомолекулярных органических и неорганических веществ ферменты присутствуют в клетках в чрезвычайно малых количествах, поэтому определение их содержания в тканевых экстрактах или биологических жидкостях представляет собой особую проблему. Тем не менее, были разработаны весьма чувствительные и специфические методы определения каталитической активности различных ферментов, на основе которых можно судить о количестве того или иного фермента в биологическом объекте.

Для оценки количества фермента в образце тканевого экстракта или биологической жидкости, измеряют скорость реакции, катализируемой присутствующим в образце ферментом. Скорость ферментативной реакции рассчитывают либо по исчезновению исходных веществ, подвергающихся каталитическому воздействию, либо по образованию и накоплению продуктов в единицу времени. В определенных условиях измеряемая скорость реакции пропорциональна количеству присутствующего фермента. Поскольку при этом трудно определить число молекул фермента в пробе или их общую массу, результаты выражают в условных единицах активности фермента. Единицы активности удобнее всего представлять в микромолях (мкмоль, 10^–6 моль), наномолях (нмоль, 10^–9 моль) или пикомолях (пмоль, 10^–12 моль) израсходованного субстрата или образовавшегося продукта в единицу времени (например, мкмоль/сек или нмоль/мин). Общепринятыми международными обозначениями единиц активности ферментов, соответственно, являются U, nU и pU.

Факторы, влияющие на активность ферментов

На активность ферментов и, соответственно, скорость ферментативной реакции влияют, в основном, следующие физико-химические факторы: концентрация фермента [E₀] и субстрата [S], температура, значение показателя концентрации водородных ионов - рН, присутствие активаторов или ингиби­торов.

Температура

С повышением температуры, в пределах некоторого весьма ограниченного интервала темпера­тур, скорость реакций, катализируемых ферментами, увеличивается. Коэффициент, показывающий, во сколько раз увеличивается скорость реакции при повышении температуры на 10°, называется тем­пературным коэффициентом Вант-Гоффа и обозначается Q₁₀. Для большинства химических реакций, а также многочисленных биохимических реакций повышение температуры на 10° приводит к увеличению скорости процесса в 2-3 раза (т.е. коэффициент Q₁₀ равен 2-3) и, аналогично, при понижении температуры на 10° скорость уменьшается в 2-3 раза. Многие физиологические про­цессы (например, скорость сокращения изолирован­ной сердечной мышцы) также подчиняются этому правилу. Типичная зависимость скорости ферментативной реакции от температуры представлена на рис. 5.6.

Как можно видеть из графика, при некой оптимальной температуре ско­рость реакции максимальна. Рост скорости реакции по мере приближения темпе­ратуры к оптимальному значению объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул, т.е. увеличением частоты сталкивания молекул фермента и субстрата. При дальнейшем росте температуры кинетическая энергия молекул самих ферментов оказывается достаточной для разрыва внутримолекулярных связей, поддерживающих вторичную и третичную структуры фер­мента в необходимом нативном, каталитически активном состоя­нии, другими словами происходит тепловая денатурация ферментов. Вторичные и третичные структуры ферментов разру­шаются, что сопровождается потерей их каталитической активности.

Рис. 5.6 Влияние температуры на скорость гипотетической ферментативной реакции.

Для большинства ферментов оптимальной тем­пературой является та температура, при которой в норме функционируют клетки. Для ферментов некоторых ми­кроорганизмов, адаптировавшихся к обитанию в естественных горячих источниках, оптимальная тем­пература может быть близка к точке кипения воды.