Конкурентное ингибирование аналогами субстрата

Классический вариант конкуретного ингибирования проявляется при взаимодействии ингибитора с активным центром фермента. Струк­тура аналога субстрата, действующего как ингиби­тор - I, обычно сходна со структурой самого субстрата. Поэтому ингибитор может обратимо связываться с ферментом, образуя вместо комплекса [ES] фермент-ингибиторный комплекс [EI]. Если в реакционной смеси одновременно присутствуют субстрат и ингибитор указанного типа, они конку­рируют за один и тот же центр связывания на по­верхности фермента. Один из наиболее подробно изученных примеров конкурентного ингибирова­ния – это ингибирование сукцинат-дегидрогеназы малоновой кислотой, которая конкурирует с субстратом фермента – сукцинатом (^–ООС–СН₂–СН₂–СОО^–) за один и тот же активный центр.

Сукцинат-дегидрогеназа катализирует образова­ние фумаровой кислоты за счет отщепления атомов водо­рода от каждого из двух -углеродных атомов сукцината. Малоновая кислота, (^–ООС–СН₂–СОО^–) выступающая в роли ингибитора способна связываться с ферментом, образуя комплекс [EI]. От единственного С_-атома малоната отщепле­ние атома водорода невозможно. Поэтому образующийся комплекс [EI] может только распадаться на свободный фермент и ингибитор.

Д ля этой обратимой реакции связывания ингибитора с ферментом:

к онстанта диссоциации (константа ингибирования) комплекса фермент-ингибитор, К_i, равна:

Д ействие конкурентных ингибиторов можно представить в виде следующей схемы:

Как упоминалось выше, скорость образования продукта зависит только от концентрации комплекса [ES]. Пред­положим, что I очень прочно связывается с фермен­том (величина K_i мала). Тогда количество свободного фермен­та [E], который мог бы связывать S, образуя комплекс [ES] с распадом последнего на E + Р, будет весьма мало. Таким образом, скорость реакции, т.е. скорость образова­ния Р будет мала. При той же концентрации слабо связывающегося ингиби­тора (величина K_i велика) катализируемая реакция существен­но не замедлится. Предположим теперь, что при фиксированной концентрации ингибитора, I, концентрация субстрата растет. Это по­вышает вероятность образования комплекса [ES] по сравнению с концентрацией комплекса [EI]. С увеличением отно­шения [ES]/[EI] будет расти и скорость ре­акции. При достаточно высокой концентрации S концентрация комплекса [EI] станет исчезающе мала. Но тогда скорость катализируемой реакции будет такой же, как и в отсутствие I.

Графическая оценка констант конкурентного ингибирования

На рис. 6.4 приведен график Лайнуивера–Берка для случая типичного конку­рентного ингибирования. Начальную скорость реакции, V_о, измеряют при разных значениях концентрации S, но при фиксированной концентрации ингибитора. Прямые, проведенные через полученные экспериментальные точ­ки, отсекают на оси у один и тот же отрезок. Длина этого отрезка, равна величине l/V_max. Это означает, что при бесконечно большой концентра­ции S (1/[S] → 0) V_max будет такой же, что и в отсутствие ингибитора. Однако длина отрезка, отсекаемого на оси х (эта величина определяет значение К_m), в при­сутствии ингибитора уменьшается ( –1/K^/_m < –1/K_m). Следовательно, конкурентный ингибитор увеличивает кажущееся значение К_m (К^/_m) для субстрата. Для про­стого конкурентного ингибирования длина отрезка, отсекаемого на оси х, будет равна:

Зная величину K_m в отсутствие I, из этого уравнения можно определить значение K_i. Значения K_i, для ряда аналогов суб­страта, т.е. конкурентных ингибиторов, показывают, ка­кой из них является наиболее эффективным. Ингибиторы, характеризующиеся наи­меньшими величинами K_i, даже при малых концентрациях могут оказывать сильное ингибирующее действие на активность фермента.

Р ис. 6.4 График Лайнуивера–Берка для случая классического конкурентного ингибирования.

Многие лекарственные препараты, широко использующиеся в клинике, действуют как конкурентные ингибиторы очень важных ферментов, функциони­рующих как в микробных, так и в животных клетках.

Обратимое неконкурентное ингибирование

Как следует из самого термина, в этом слу­чае конкуренция между S и I за сайт связывания отсутствует. При этом ингибитор обычно ничем не напоминает S и, как мо­жно предполагать, связывается с участком фермента, отличным от активного центра. Обратимые неконкурентные ингибиторы снижают максимальную скорость реакции при данном количестве фермента, но, как правило, не влияют на величину K_m. Поскольку I и S связы­ваются с разными центрами, возможно образование как комплекса [EI], так и комплекса [EIS]. Комплекс [EIS] также распадается с образова­нием продукта, однако с меньшей скоростью, чем при распаде комплекса [ES]; поэтому в присутствии таких ингибиторов реакция замедляется, но не останавливается. Ниже указаны возможные варианты образования комплексов [ES], [EI], [EIS] и пути их распада:

На рис. 6.5 представлена зависимость 1/V_о от 1/[S] в присутствии и в отсутствие ингибитора (предпола­гается, что связывание I не приводит к существен­ным изменениям в структуре активного центра).

Рис. 6.5 Графическое изображение обратимого неконкурентного ингибирования в координатах Лайнуивера–Берка.

Необратимое неконкурентное ингибирование

Ферментативная активность может уменьшаться в присутствии многих «ядов», таких, как иодацетамид, ионы тяжелых металлов (Ag⁺, Hg²⁺), оки­сляющие агенты и т.д. В присутствии одного или нескольких субстратов или продуктов скорость инактивации фермента может снижаться. Кине­тический анализ, применимый к обратимому неконкурентному ингибированию, о котором шла речь выше, может оказаться неприемлемым для того, чтобы отличить действие ферментных ядов от действия неконкурент­ных обратимых ингибиторов. Обратимое неконку­рентное ингибирование встречается сравнительно редко. К сожалению, оно не всегда выявляется, по­скольку и обратимый, и необратимый типы неконкурент­ного ингибирования характеризуются сходной кине­тикой.

Принцип метода

В теоретическом приложении к лабораторной работе №5 было указано, что скорости ферментативных реакций рассчитывают либо по убыли исходных веществ т.е. субстратов, подвергающихся каталитическому воздействию, либо по образованию и накоплению продуктов реакции в единицу времени. Одним из примеров реакций, часто используемых в лабораторных практикумах для определения кинетических параметров, является реакция гидролиза крахмала под действием амилазы слюны. Следует, однако, помнить, что корректное определение главных кинетических параметров ферментативных реакций – константы Михаэлиса, К_m, и максимальной скорости, V_max, возможно лишь в условиях начальной стадии процесса, когда концентрация субстрата велика и практически соответствует его исходному коли­честву, фермент находится в состоянии насыщения и, следовательно, скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса [ES]. Вполне понятно, что при высокой концентрации субстрата, как это имеет место в случае гидролиза крахмала, следить за начальной скоростью реакции по его убыли затруднительно. Поэтому наиболее грамотно определять начальную скорость процесса не по убыли субстрата, а по накоплению продукта реакции.

И сходя из сказанного выше, удобной системой для расчета К_m и V_max в условия in vitro может быть ацетилхолинэстераза (АХЭ) мембран теней эритроцитов, которая катализирует реакцию гидролиза сложноэфирной связи в ацетилхолине (АХ) с образованием холина и ацетата:

В ферментативной кинетике успех определения кинетических параметров зависит не только от выбранной ферментной системы, но и от чувствительности и адекватности метода анализа продукта или продуктов реакции. В нашем случае в качестве субстрата ацетилхолинэстеразы целесообразно использовать не ацетилхолин, а его аналог – ацетилтиохолин (АТХ):

Г лавная идея использования ацетилтиохолина в качестве субстрата ацетилхолинэстеразы заключается в том, что в результате гидролиза тиоэфирной связи в этом субстрате один из продуктов реакции – тиохолин содержит сульфгидрильную группу:

Накапливающийся тиохолин взаимодействует с 5,5'-дитиобис[2-нитробензойной кислотой] (реактив Эллмана) с образованием 2-нитро-5-меркаптобензойной кислоты, которая окрашена в желтый цвет, причем интенсивность окраски пропорциональна содержанию в реакционной смеси 2-нитро-5-меркаптобензойной кислоты и, следовательно, тиохолина.

Приведенные выше рассуждения позволяют сделать вывод о том, что система ацетилхолинэстераза-ацетилтиохолин является во всех отношениях удобной не только для расчета значений К_m и V_max реакции гидролиза ацетилтиохолина, но позволит также определить значение константы ингибирования этой реакции, К_i, при использовании в качестве ингибитора естественного субстрата ацетилхолинэстеразы – ацетилхолина.

Контрольные вопросы

1. Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативных реакций

2. Уравнение Михаэлиса–Ментен. Уравнение Лайнуивера-Берка

3. Графическое определение величины константы Михаэлиса

4. Типы ингибирования активности ферментов. Графическое определение величин констант Михаэлиса в отсутствие и в присутствии ингибиторов

5. Принцип метода определения кинетических параметров реакции гидролиза сложноэфирной связи под действием ацетилхолинэстеразы

Литература

1. Диксон М., Уэбб Э., Ферменты, т. 1, «Мир», М., 1982

2. Диксон М., Уэбб Э., Ферменты, т. 2, «Мир», М., 1982

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В., Биохимия человека, т. 1, «Мир», М., 1993

4. Горячковский А.М., Справочное пособие по клинической биохимии, ОКФА, Одесса, 1994

5. Степанов В.М., Молекулярная биология: структура и функции белков, под ред. академика Спирина А.С., «Высшая школа», М., 1996

6. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., Биологическая химия, «Высшая школа», М., 1998

7. Кольман Я., Рем К.-Г., Наглядная биохимия, «Мир», М., 2000

Ход работы

Тема: Кинетика ферментативных реакций. Регуляция активности ферментов