Кривые плавления
Для этого после окончания реакции реакционную смесь нагревают и непрерывно измеряют флуоресценцию. При достижении температуры плавления продукта амплификации резко снижается флуоресценция.
Любое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получающихся на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов. Для облегчения работы с полученной информацией проводится дифференциальный анализ кривой плавления. Подобный способ визуализации полученных данных является более удобным для понимания и анализа.
Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификации с помощью бромистого этидия и SYBR Green I. При использовании кривых плавления в системах с ДНК-зондами (Taq-man assay, beacons) различают точечные мутации, которые расположены внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Наличие таких мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и к изменениям в графике кривой плавления. Использование кривых плавления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных особых манипуляций с пробирками, а трактовка полученных данных формализована и автоматизирована.
Пцр в реальном времени с реакцией обратной транскрипции
Этот метод был изобретен для детекции количества ДНК в пробе, но в последнее время все чаще используется немного видоизмененный количественный ПЦР для детекции РНК. Метод носит название ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции (ОТ-кПЦР , RT-qPCR). Он часто используется для характеризации или сравнения уровней мРНК в разных популяциях.
Перед тем, как проводят стандартный ПЦР в реальном времени, необходимо провести реакцию обратной транскрипции для синтеза кДНК. Реакция обратной транскрипции проводится с помощью фермента — обратной-транскриптазы (РНК-зависимой ДНК полимеразы, ревертазы). Реакцию возможно проводить без добавления праймера, тем не менее, наибольшая эффективность достигается, когда праймер добавлен. Имеется три основных типа праймеров:
Олиго dT праймеры. Гибридизуются с polyA последовательностью, имеющейся на 3’ -конце многих эукариотических мРНК.
Случайная последовательность. Чаще всего могут использоваться либо гексамеры, либо нонамеры. Данные последовательности могут транскрибировать все мРНК
Ген-специфичные праймеры. Используются в случае, когда исследуется мРНК, которая экспрессируется с определенного гена.
Реакция обратной транскрипции — главный этап в этом подходе, так как количество кДНК должно соответствовать количеству изучаемой мРНК. РНК-молекула менее стабильна, чем ДНК, поэтому при выделении РНК и проведении ОТ-кПЦР нужно тщательно следить за чистотой процедур и не допускать попадания большого количества РНКаз.
Полуколичественный пцр
Полуколичественный ПЦР (semi-quantitative PCR) —это модифицированный метод количественного ПЦР с реакцией обратной транскрипции. Данный метод используется для сравнения экспрессии нескольких генов. В этом случае необходимо измерить количество накопленного продукта только в одной точке — после прекращения реакции. ПЦР реакция прекращается тогда, когда предполагается, что накопление продукта находится в экспоненциальной фазе роста и ПЦР-продукт можно детектировать. После электрофореза можно измерить разницу в экспрессии нескольких образцов.