21

Оглавление

2

ВВЕДЕНИЕ 3

1. ОПИСАНИЕ МЕТОДА 3

2. ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ 5

2.1 Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay) 5

2.2 Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons) 7

2.3 Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay) 8

2.4 Использование интеркалирующих агентов 8

3. КРИВЫЕ ПЛАВЛЕНИЯ 10

4. ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ С РЕАКЦИЕЙ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ 11

5. ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ПЦР 12

6. ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ 12

6.1 Модель ViiA7 12

6.2 Модели 7500 и 7500 Fast 13

6.3 Модели StepOne и StepOne Plus 14

7. ПРИМЕНЕНИЕ 15

7.1 Диагностические исследования 15

7.2 Выявление циркулирующих опухолевых клеток 16

7.3 В микробиологии 17

7.4 Научные исследования 17

7.5 кПЦР для определения количества малых ядрышковых РНК (мяРНК) 17

7.6 ПЦР в реальном времени для измерения количества белка 18

7.7 Обнаружение фитопатогенов 18

7.8 Детекция генетически модифицированных организмов 18

8. ПРЕИМУЩЕСТВА ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ 19

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 20

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 21

Введение

ПЦР в реальном времени ( Real-time PCR, qPCR, qRT-PCR) — лабораторный метод, который основан на методе полимеразной цепной реакции. Данный метод применяется для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК. Он включает в себя детекцию и одновременно количественное определение специфической последовательности ДНК в образце.

Главная особенность ПЦР в реальном времени - возможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения реакции. Так как кинетика накопления ампликонов напрямую зависит от числа копий исследуемой матрицы, это позволяет проводить количественные измерения ДНК и РНК инфекционных агентов. ПЦР в реальном времени не требует дополнительных действий, связанных с раститровкой ДНК исследуемой пробы или полученных в ходе ПЦР ампликонов, которые усложняют постановку анализа и могут приводить к появлению ложноположительных результатов. Это является главным отличием метода от других. Благодаря данному подходу можно отказаться от стадии электрофореза. Это ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также позволяет снизить требования, которые предъявляются к ПЦР лаборатории.

1. Описание метода

Процедура очень похожа на процедуру классической ПЦР, в ней присутствуют все стадии реакции — плавление или денатурация двухцепочечных ДНК при температуре 95˚C, отжиг праймеров (температура отжига зависит от используемых праймеров) и элонгация при температуре 72˚С, если используется Taq-полимераза. Принцип ПЦР в реальном времени заключается в детекции ПЦР-продукта по мере его накопления. На сегодняшний день это возможно сделать благодаря высокоспецифичным флуоресцентным зондам. Существует два основных подхода генерации света у таких зондов — во время элонгации и отжига, но и в том, и в другом случае, флуоресценция усиливается с каждым новым циклом. Сила сигнала говорит о начальном количестве интересующей молекулы.

На первых этапах реакции продукта не очень много, поэтому флуоресценция слабая, её трудно отличить от фона. По мере накопления продукта, сигнал растет сначала экспоненциально, а затем выходит на плато. Выход на плато объясняется тем, что может не хватать того или иного компонента реакции — могут закончиться праймеры, нуклеотидилтрифосфаты, метка. Когда продукта реакции накопилось слишком много, лимитирующим фактором может стать фермент, в этом случае зависимость количества продукта от цикла станет линейной. В стандартной реакции ПЦР в реальном времени все образцы выйдут на плато и достигнут примерно одного уровня сигнала. Таким образом, конечная точка ничего не скажет о начальном количестве исследуемого образца. Тем не менее, в экспоненциальной фазе можно проследить отличия в скорости роста продукта. Различия в первоначальном количестве молекул влияют на количество циклов, которые необходимы для понятия уровня флуоресценции выше уровня шума.

СТ-величина - количество циклов, необходимое для того, чтобы флуоресценция достигла порогового уровня (над шумом). Пороговый уровень — это не строго определенная величина, она может подбираться для каждого случая отдельно.

СТ-величина может зависеть от многих случайных факторов, таких как качество фильтра, чувствительность детектора и так далее. Поэтому точно начальное количество интересующего продукта измерить нельзя. Для решения этой проблемы существуют разные методы нормировки. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе. Нормируют обычно на продукты генов домашнего хозяйства — таких генов, количество которых в клетке всегда приблизительно одинаковое (Пример — ген infA, кодирующий фактор инициации трансляции у бактерий). Соотношение определяют по следующей формуле: [N₀ ]_A/[N₀ ]_B = (1+E)^(CT_B^-CT_A⁾

Где [N₀ ]_A и [N₀ ]_B — первоначальные количества двух образцов, CT_B и CT_А — соответствующие CT-величины, E — эффективность ПЦР, приравнивающаяся в большинстве случаев к 1 или 0.9