52. Получение чистых линий бактериофагов

На практике при получении мутантов, генетическом анализе и т.п. часто приходится выделять чистые линии бактериофагов, представляющие собой потомство одной фаговой частицы. Существуют приемы, позволяющие произвести выделение чистых линий бактериофагов с

минимальными затратами питательных сред и времени.

Техника получения чистых линий фагов

Смесь Т-четных и Т-нечетных бактериофагов, образующих крупные и мелкие негативные колонии, высевают на газон бактерий E. Coli B. Для этого в полужидкий 0,7 % расплавленный агар вносят 0,2 мл культуры бактерий, перемешивают и наслаивают в чашки Петри на поверхность 1,5 % питательного агара. Чашки подсушивают, затем полоски стерильной фильтровальной бумаги обмакивают в смесь бактериофагов и проводят ими параллельные линии по газону бактериальной культуры (сверху вниз, до 10 линий на чашку). Чашки помещают в термостат на 37 °С. В местах нанесения фага будут видны зоны лизиса бактериальной культуры, причем на первых полосах лизис будет более выражен, а на последних будут видны отдельные негативные колонии фагов. Отмечают две изолированные колонии: крупную и мелкую, и с помощью бактериологической петли переносят каждую вместе с агаром в отдельную пробирку с 1 мл бульона. Из каждой пробирки с помощью стерильной бумажной полоски производят рассев фага на газон чувствительных бактерий. Чашки инкубируют при 37 °С. Убеждаются, что после расчистки на каждой чашке формируются негативные колонии одного типа, в противном случае процедуру расчистки повторяют. Линия фага считается чистой, когда однородные негативные колонии фага образуются на протяжении не менее 5 пассажей

53. Особенности репликации вируса гепатита в.

Вирионы гепатита В (частицы Дейна) Сферической формы с диаметром 42-45 нм. Они состоят из сердцевины диаметром 27 нм, содержащей вирусную двунитчатую ДНК, окруженную мембранной толщиной 7 нм. Наряду с полноценными вирионами встречаются в гораздо большем количестве частицы, состоящие лишь из фрагментов наружной оболочки. Они могут быть сферическими с диаметром 16-25 нм и нитевидными (10-20 нм) длинной до 700 нм. Нитевидные структуры являются агрегатами сферических частиц. Частицы содержат поверхностный антиген вируса –HBs-антиген и накапливаются в результате избыточной продукции поверхностного компонента частиц Дейна. Частицы HBs антигена не обладают инфекционной активностью, однако, они являются маркером на возможное присутствие частиц Дейна в исследуемом материале.

Гепатит В (гепабновирус) – подгруппа ДНК-содержащих вирусов, содер. двунитевую ДНК.

Размножается в клетках печени является предраковым, возможен рак печени.

Достигая кл. печени вирус адсорбируется на поверхности, инфицированные гепатиты атакуются и разр-ся в ходе иммунол. реакций.

Геном вируса гепатита В не встраивается в геном клетки и в отличие от ретровирусов не проходит стадию интермедиата ДНК в процессе репродукции. Если обнаруживаются в клетке фрагменты генома вируса гепатита В, то эта ситуация является инициирующей для процесса превращения клетки в злокачественную. С этим связанна онкогенная функция гепатита В.

Схема репродукции вируса:

Родительская геномная ДНК вируса имеет разрывы в одной нити, вторая нить стабилизирует эти структуры. Полимеризующие ферменты вириона на первых этапах репродукции обеспечивают заделывание этих брешей (репарацию) и превращение в двунитевую структуру мол. ДНК. Эта мол. транскрибируется и возникает РНК:

1. «+» иРНК транскрибируется в белки, среди которых обратная транскриптаза, полимераза, специфическая иРНК (?) которая участвует в репликации ДНК.

2. Возникает при транскрипции, является матрицей для синтеза с помощью обратной транскриптазы двунитевой мол. ДНК, включающаяся вместе со структурными белками в образовании зрелого потомства.

Существует генно-интженерная вакцина против гепатита В: созданная по технологиям рекомбинантных ДНК, автор Кент Мурей.