26. Бактериофаги как переносчики генетической информации бактерий. Фаговая трансдукция и фаговая конверсия.

Фаги, как и вирусы позвоночных, беспозвоночных и расте­ний, по содержанию НК подразделяются на ДНК- и РНК-содержащие, а по характеру взаимодействия с бактериями - на вирулентные и умеренные с полноценным и де­фектным геномами.

Различают простые и сложные фаги. При этом простые имеют форму шестигранников (колифаги MS-2, f2, фХ174) или нитей (фаги fl, fd), а сложные (колифаги группы Т1-Т7) - сперматозоидную.

Приобретение новых признаков, обусловленных профагом, называется фаговой (лизогенной) конверсией. Фаговая конверсия может затрагивать такие важные свойства бактерий как морфология колоний, биохимические признаки, способность синтезировать токсины или антибиотики, устойчивость к лекарственным препаратам и др. Утратившие часть своего генома умеренные фаги становятся дефектными и, будучи не способными к образованию зрелых частиц, осуществляют трансдукцию (лат. transductio - пере­нос, перемещение), т. е. перенос генов.

Трансдукция - вид рекомбинации, при которой перенос гене­тического материала от одних клеток (доноров) к другим (реци­пиентам) осуществляют умеренные фаги или их мутанты.

Установлено, что за трансдукцию ответственны умеренные фаги, потерявшие способность лизогенизировать бактериальные клетки вследствие того, что часть их генома при неправильном отщеплении замещается фрагментом ДНК бактерии-донора. Та­кие мутанты фагов называют дефектными фаговыми корпуску­лами или дефектными фагами. Они всегда присутствуют в попу­ляции фагов, освобождаемых клетками в среду после индукции или суперинфекции. С помощью трансдуцирующего фага могут передаваться многие признаки и свойства: способность сбражи­вать различные углеводы, синтезировать аминокислоты и вита­мины, резистентность к антибиотикам, вирулентность, токсигенность, жгутики. При этом трансдуцирующие свойства фага не зависят от способности лизироватъ или лизогенизировать реципиентную клетку.

Виды трансдукции. По характеру передачи признаков раз­личают три вида трансдукции - генерализованную, ограничен­ную (специализированную) и абортивную.

Генерализованную, или общую, трансдукцию осуществляют фаги с множественной локализацией на хромосоме бактерий. К ним, в частности, относится умеренный фаг Ми-1, содержащий линейную двухцепочечную ДНК.

Ограниченную трансдукцию связывают с фагами, обладаю­щими избирательной локализацией на хромосоме бактерий и способными переносить ограниченное число генов, прилегаю­щих к специфическим участкам интеграции. Этот вид трансдук­ции осуществляют умеренные фаги X, Р2, Р22 и многие другие.

Абортивная трансдукция отличается от первых двух тем, что перенесенный фагом фрагмент ДНК донора остается в ци­топлазме реципиентной клетки в автономном состоянии. Не включаясь в хромосому клетки-реципиента, этот фрагмент ДНК в течение нескольких делений бактерий передается лишь одной клетке, а далее полностью исчезает.

27. Генетическая организация фага λ

Основное отличие – могут быть в 3-х состояниях:

• Вирион

• Вегетативный фаг

• Профаг

Длинный хвостовой отросток, ДНК 2-х цепочечная, линейная внутри головки.

На 5/-конце каждой ее цепи имеется одноцепочечная последовательность из 12 нуклеотидов – липкие концы (cos-сайты). Сразу же после проникновения фаговой ДНК в бактериальную клетку, липкие концы ДНК ковалентно соединяются ДНК-лигазой клетки-хозяина и образуется кольцевая молекула.

Далее, как правило, эта кольцевая молекула бактериофаговой ДНК не приступает к транскрипции, а встраивается в бактериальную хромосому. Установлено, что гены фага λ кодируют синтез четырех регуляторных белков, один из которых репрессорный белок сI (кодируется геном сI) блокирует развитие событий литического цикла, а антирепрессорный белок Cro (кодируется геном сro), наоборот, запускает их. После поступления ДНК фага λ в клетку, выбор между литическим и лизогенным путями развития зависит от относительной скорости накопления регуляторных белков: если преобладает антирепрессорная функция белка Cro, то развиваются события литического цикла, если успевает проявиться функция репрессорного белка сI, литический цикл не осуществляется, так как белок сІ связывается с ДНК фага λ в особых участках, препятствуя транскципции фаговых генов.

Встраивание ДНК фага λ в бактериальную хромосому осуществляется согластно интегративной модели А.Кемпбелла. Этот процесс называется сайт-специфической рекомбинацией, так как встраивание ДНК фага λ осуществляется в одном и том же месте (сайте) между генами gal и bio и не зависит от rec A-системы бактериальной клетки.

За интеграцию ДНК фага λ ответственен фермент лямбда-интеграза. Этот фермент узнает две разные последовательности – одну в хромосомной ДНК (att λ), а другую в ДНК фага (b2). Затем происходит разрыв обеих молекул ДНК и последующее их перекрестное воссоединение.

После этого ДНК фага λ реплицируется с клеточной ДНК как единая структура, и все дочерние клетки при делении получают копию фаговой ДНК в составе хромосомы. Подобные клетки называются лизогенными, а ДНК фага λ в них – профагом.

Линейная мол ДНК длиной 49000 п.н. Гены фага можно разбить на 2 группы: существенные для формирования негативных колоний и несущественные. Сущ гены идентифицируются с помощью условно летальных мутаций: либо sus, либо ts. Эти мутции локализованы в 25 различных цистронах(оперонах). 7 отвечают за формирование нормального хвостового отростка, 7-за формирование головки фага. Эти гены необходимы для правильной сборки фаговых частиц, либо кодируют структурные белки, входящие в состав фага. 2 гена обеспечивают лизис клетки и высвобождения потомства фага. Еще 2 гена обеспечивают репликацию ДНК фага, остальные 3-регуляторные.

Несущественные гены идентифицируются по морфологии негативных колоний или при делециях участков генома, в кот они локализованы. Делеции в фаге обнаружить легко, поскольку несущие делеции фаги содержат в головке меньше ДНК по сравнени с нормальным фагом, следовательно их ДНК хараетеризуется иной плотностью, что выявляется при центрифугировании в градиенте хлористого цезия.