13. Наиболее значительные достижения вирусологии и перспективы ее развития. Значение вирусологии в жизни человека

К числу важнейших достижений вирусологии относится установление роли вирусов в возникновении опухолей у животных (Ф.Раус, 1911) и человека (X. цур Хаузен, 1980-е гг.). В 1961 Л. А. Зильбер предложил вирусогенетическую теорию возникновения рака. Были описаны особые вирусные, а затем и клеточные гены - онкогены, ответственные за превращение нормальных клеток в опухолевые а также гены, ответственные за подавление этого процесса (антионкогены, или супрессоры) (Г. Мартин, 1970; Д. Стелен; X.Вармус и Дж.М.Бишоп, 1976).

В процессе изучения вирусов был описан механизм интеграции вирусного генома в геном клетки-хозяина (А.Львов, А Херши, Ф.Жакоб, Ж.Л.Моно, 50-е годы, Дульбекко, 1966) и обнаружены эндогенные вирусы человека и животных (П. Бентвельцен, 1968; Р. Хюбнер и Дж. Тодаро, 1970).

Развитие вирусологии привело к открытию инфекционных агентов, по сути не являющихся вирусами. В 1971 году Т.О.Динер описал вироиды, представляющие собой инфекционную низкомолекулярную одноцепочечную кольцевую РНК, не кодирующую собственные белки. Крупным успехом вирусологии явилось открытие и выяснение природы прионов –инфекционных белков с нарушенной трехмерной структурой, возбудителей нейро-дегенеративных заболеваний человека и животных, принципиально отличающихся от вирусов (Д. К. Гайдушек, 1950-60-е гг.; С. Прузинер, 1980-90-е гг.).

Малые размеры и способность к образованию регулярных структур открыли перспективу использования вирусов в нанотехнологии для получения новых бионеорганических материалов: нанотрубок, нанопроводников, наноэлектродов, наноконтейнеров, для инкапсидации неорганических соединений, магнитных наночастиц и неорганических нанокристаллов строго контролируемых размеров. Новые материалы могут быть созданы при взаимодействии регулярно организованных белковых вирусных структур с металлосодержащими неорганическими соединениями. «Сферические» вирусы могут служить наноконтейнерами для хранения и доставки в клетки лекарственных препаратов и терапевтических генов. Поверхностно модифицированные инфекционные вирионы и вирусные субструктуры могут быть использованы в качестве наноинструментов (например, в целях биокатализа или получения безопасных вакцин).

На вирусах изучаются вопросы генетики микробов и актуальные проблемы биохимии. Изучение вирусов привело к расшифровке генетического кода,выявлению механизмов мутации.Вирусы широко применяюстя в работах генной инженерии.Люди-жертвы вирусных заболеваний и актуальной остаётся проблема в и зученнии этих болезней и борьбе с ними.

17. Титр бактериофага, методы его определения. Медоды выявление вирусов животных и растений. В методичке

18. Методы получения фаголизатов и их использование на практике..

Фаголизат - суспензия бактериофага, полученная после лизиса зараженных фагом клеток бактерий. Для получения фаголизатов можноиспользовать как жидкие, так и агаризованные питательные среды. Фаголизат получают путем размножения фага на клетках чувствительной культуры. В бульонную культуру бактерий E.coli B вносят 1-2 мл фаговой суспензии, либо касаются бактериальной петлей изолированной негативной колонии и эмульгируют ее в питательном бульоне. После соответствующего периода инкубирования и просветления сус-

пензии фаголизат освобождают от бактериальных клеток одним их следующих способов:

1) фильтрованием через мембранный фильтр;

2) центрифугированием для осаждения клеток (6000 об/ми, 10мин);

3) обработкой фаголизата хлороформом в соотношении 10:1 с последующим энергичным встряхиванием в течение минуты, инкубированием в течение часа при комнатной температуре и центрифугированием.

Техника получения фаголизатов бактериофагов Т-группы в жидкой питательной среде

18-24 часовую культуру чувствительных к фагу бактерий (E. coli B) засевают в жидкую питательную среду в соотношении 1:10 и культивируют с аэрированием при оптимальных условиях (37о С) до логарифмической фазы роста в течение 2,5 - 3 ч (до плотности 2х108 кл/мл). Послеэтого в бактериальную культуру добавляют суспензию фага с такимрасчетом, чтобы множественность инфекции составляла 1, и продолжают инкубирование в течение 6 - 8 часов с аэрацией до просветлениябактериальной культуры.Фаголизат освобождают от бактерий низкоскоростным центрифугированием (6000 об/мин, 10 мин) или фильтрованием через бактериальные фильтры и определяют титр полученного фага.В жидкой среде можно получать большие объемы фаголизатов ссодержанием фаговых частиц около 5 х 109 частиц/мл.

Техника получения фаголизата бактериофагов Т-группы на агаризованной питательной среде

Этот метод, предложенный М. Свансторомом (M. Swanstrom) и М. Адамсом (M. Adams) в 1951г., заключается в лизисе фагом густой суспензии чувствительных бактерий в слое полужидкого агара. В 3 мл 0,7% агаризованной питательной среды вносят 0,1 мл культуры чувствительных бактерий E. coli B в логарифмической фазе роста и 1 мл суспензии одного из фагов Т-группы (конечная концентрация 104 - 105 частиц/ мл), перемешивают и выливают на поверхность 1,5 % агаризованной питательной среды в чашках Петри. Таким образом проводят засев нескольких чашек. Чашки инкубируют в течение 18 - 20 часов, а затем в каждую из них вносят 5 мл физиологического раствора или жидкой питательной среды и шпателем осторожно снимают верхний (0,7%) слой агара. Для удаления бактерий и остатков агара полученную массу центрифугируют (6000 об/мин, 10 мин). После серии разведений полученного фаголизата определяют титр фага. Экспериментально выявлено, что на плотной питательной среде количество полученного фаголизата оказывается меньше, чем в случае приготовления его в жидкой питательной среде, но титр бактериофага в этом случае несколько выше – 109 – 1011 частиц/мл.